抗体-siRNA偶联物在无阳离子辅助条件下实现肿瘤细胞基因沉默的潜力探索

本研究针对siRNA在肝外疾病治疗中的递送难题，开发了结构明确的DAR2抗体-siRNA偶联物(ARCs)。通过优化连接子结构和半胱氨酸工程位点，实现了高效偶联，并证明无需阳离子辅助即可在多种肿瘤细胞中诱导有效基因沉默(70-80% mRNA敲降)。该研究揭示了siRNA稳定性和摄取时间间隔对RNAi效力的关键影响，为癌症等肝外疾病的治疗提供了新策略。

　　

在生物医药领域，如何将治疗性siRNA精准递送至肝外组织一直是重大挑战。尽管siRNA理论上可以沉默任何疾病相关基因，但现有递送系统（如LNP和GalNAc）仅能靶向肝脏细胞。这导致FDA已批准的7种siRNA药物全部局限于肝脏疾病应用，而占疾病大头的癌症等肝外疾病仍缺乏有效递送手段。抗体因其靶向性和长半衰期被视为理想载体，但siRNA与抗体偶联后面临内体逃逸效率低的核心难题——此前研究仅能在特定组织（如肌肉）或特殊靶点（如TenB2和BCMA受体）实现有限沉默效果。

武汉大学的研究团队在《Bioconjugate Chemistry》发表的研究中，通过系统优化抗体-siRNA偶联物(ARCs)的结构和化学稳定性，成功突破了这一技术瓶颈。研究人员采用刚性连接子sulfo-SMCC和HC-A118C位点的ThioMab偶联策略，结合阴离子交换纯化工艺，制备出DAR接近2的均质化ARC产物。通过细胞实验、小动物成像和药效评价等多维度验证，揭示了无需阳离子辅助条件下实现肿瘤细胞高效基因沉默的新机制。

关键技术包括：1) 基于结构预测的ThioMab半胱氨酸位点工程化筛选；2) 不同化学修饰模式(Alt OMe/ESC/Adv ESC)的siRNA稳定性评估；3) 内体逃逸过程的时序追踪；4) HCC1954异种移植瘤模型的药效学评价；5) ELISA法检测血清中ARC稳定性。

ThioMab Conjugation of siRNA Using the Rigid Linker
研究发现刚性连接子sulfo-SMCC在HC-A118C位点的偶联效率显著优于柔性连接子，所得DAR1.9产物能保持完整抗体结合活性。通过还原型SDS-PAGE和阴离子交换色谱证实，该策略可减少DAR1杂质的产生。

Selection of siRNA Conjugation Sites on Antibody
比较HC-A118C、LC-V205C等4个工程化位点发现，位于CH1结构域且pK_a值最低的HC-A118C反应性最佳。偶联位点不影响siRNA的RISC装载效率，所有ARC变体经RNAiMAX转染后均显示与游离siRNA相当的PLK1基因沉默效果。

RNAi Efficiency Is Determined by the Stability of Trapped siRNAs against Degradation
关键突破在于发现完全修饰的Adv ESC模式siRNA（含2′-O-甲基和硫代磷酸酯修饰）可将基因沉默效果提升21%。延时实验显示最大mRNA敲降（70-80%）出现在摄取后第4天，表明内体逃逸是缓慢的限速步骤。血清稳定性实验揭示磷酸二酯键是ARC的主要降解位点(t_1/2～30h)。

Structurally Stable ARCs Induce Gene Silencing Effect across siRNA Sequences, Cell Lines, and Antibody Targets
在HER2高表达的NCI-N87细胞中，5nM ARC即可引发显著基因沉默。靶向PTEN、CTNNB1等多基因的ARC均显示类似效果。特别值得注意的是，靶向"冷受体"（如HER2）的ARC通过延长孵育时间也能实现与"热受体"（如TfR1）相当的沉默效率。

In Vivo Delivery of ARCs to Tumors
小鼠实验显示ARC虽循环半衰期较短(t_1/2～8h)，但能选择性富集在HCC1954异种移植瘤中。两次给药（20mg/kg）可显著抑制肿瘤生长，且无体重减轻等副作用。组织分布分析显示ARC主要分布于肿瘤边缘区域，穿透深度有限。

这项研究的重要意义在于突破了ARCs仅适用于特定受体的传统认知，证明通过化学优化可扩展至常规肿瘤靶点。研究首次阐明siRNA稳定性与内体逃逸效率的正相关性，为设计新一代ARC提供了理论依据。尽管存在循环半衰期短和肿瘤穿透性不足等挑战，该研究为开发肝外疾病（尤其是实体瘤）的siRNA疗法开辟了新途径。未来通过优化连接子化学、提高DAR值以及开发新型内体逃逸增强策略，有望进一步提升ARC的治疗指数。