综述：构建甲基营养型细胞工厂的代谢工程策略

本综述系统探讨了以一碳化合物甲醇（CH3OH）为底物的合成生物学策略，重点解析了甲基营养型细胞工厂（Methylotrophic Cell Factories）构建中的三大核心挑战：甲醇同化途径（Methanol Assimilation Pathway）优化、有毒中间体甲醛（Formaldehyde）解毒机制及细胞资源分配调控，为C1生物制造产业化提供理论框架。

　　

甲醇作为生物制造底物的潜力

甲醇凭借其储量丰富、价格低廉和可持续特性，成为替代传统糖基碳源（如葡萄糖）的理想选择。其完全还原的甲基结构（-CH₃）可通过核酮糖单磷酸途径（RuMP）或丝氨酸循环（Serine Cycle）进入中心代谢，但能量利用效率仅为糖代谢的60-70%，这成为制约产业化的重要瓶颈。

途径工程优化策略

天然甲基营养菌（如Methylobacterium extorquens）的甲醇脱氢酶（MDH）催化效率较低，研究者通过定向进化获得突变体Mdh*，其k_cat/K_m值提升3.8倍。在大肠杆菌（E. coli）中引入异源二羟基丙酮合酶（DAS）与二羟基丙酮激酶（DAK）构成的"DAK途径"，使甲醇转化率提高至0.35 g/g DCW。值得注意的是，通过动态调控模块平衡NADH/NAD⁺比例，可显著减少代谢溢流现象。

甲醛毒性控制技术

甲醛作为甲醇氧化的关键中间体，浓度超过5 mM时会引发DNA-蛋白质交联。工程化策略包括：1）过表达谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶（FrmA），使胞内甲醛维持在<2 mM；2）构建甲醛感应启动子（P_frmR）驱动的保护蛋白表达系统；3）引入来自毕赤酵母（Pichia pastoris）的二氢丙酮合成途径分流代谢压力。

细胞资源再分配创新

采用CRISPRi技术抑制TCA循环竞争途径，使碳通量向目标产物（如丙酸）倾斜。最新研究显示，通过适配体（Riboswitch）调控核糖体结合位点（RBS）强度，可使甲酸（Formate）产量提升40%。微流体单细胞分析证实，代谢振荡器（Metabolic Oscillator）能有效缓解群体异质性问题。

未来挑战与展望

当前最大障碍是能量（ATP）转化效率不足，解决思路包括：1）开发非天然辅酶（NADPH）再生系统；2）设计跨膜质子梯度耦合装置；3）探索甲醇-氢气共利用模式。在产业化层面，需要开发耐受工业粗甲醇（含5%杂质）的菌株，这要求对甲醇氧化酶（MOX）进行底物特异性改造。

该领域正从基础研究向中试规模迈进，2024年发表的3L发酵罐数据显示，工程菌株能以1.2 g/L/h速率生产聚羟基脂肪酸酯（PHA），标志着C1生物经济时代的临近。