ATM介导的DHX9 S321位点磷酸化调控其在DNA双链断裂位点的滞留及与BRCA1互作机制研究

本研究揭示了DNA双链断裂(DSB)修复中DHX9 helicase的关键调控机制。研究人员发现ATM激酶依赖的DHX9 S321磷酸化可促进其在DSB位点的滞留，但磷酸化模拟突变会削弱与BRCA1的互作，表明动态磷酸化调控对同源重组修复(HR)效率至关重要，为癌症治疗靶点开发提供了新思路。

　　

在基因组稳定性维持的永恒课题中，DNA双链断裂(DSB)堪称最危险的DNA损伤类型。电离辐射和抗癌药物等因素导致的DSB若修复不当，可能引发染色体畸变甚至细胞癌变。哺乳动物细胞主要依赖两种修复机制：快速但易出错的非同源末端连接(NHEJ)，以及精确但仅在S/G₂期激活的同源重组修复(HR)。近年来研究发现，DNA-RNA解旋酶家族成员DHX9在HR过程中发挥关键作用，但其精确调控机制仍是未解之谜。

研究人员通过系统性实验揭示，在拓扑异构酶抑制剂依托泊苷(etoposide)诱导DSB后，ATM激酶特异性磷酸化DHX9第321位丝氨酸(S321)。细胞周期同步化实验显示，S期时仅染色质结合态的DHX9被磷酸化，而G₁期则以可溶态为主。这种时空调控特性暗示DHX9可能在不同细胞周期阶段执行差异化功能。

研究采用激光显微照射活细胞成像、中性彗星实验、免疫共沉淀等关键技术。通过构建DHX9敲除细胞系及系列磷酸化位点突变体（S321A模拟非磷酸化，S321E模拟持续磷酸化），结合同步化细胞周期分析，系统解析了磷酸化修饰的功能影响。

研究结果主要包括：

1. DHX9在DSB诱导后被磷酸化：免疫印迹证实依托泊苷处理可触发DHX9 S/TQ基序磷酸化，该修饰能被磷酸酶消除，且动态变化与早期DSB修复事件同步。

2. ATM特异性磷酸化S321位点：激酶抑制剂筛选和siRNA敲降实验表明ATM是主要调控激酶。质谱分析保守性显示，S321所在SQ基序在脊椎动物中高度保守。

3. 细胞周期依赖性磷酸化模式：S期染色质结合的DHX9优先被磷酸化，而G₁期磷酸化主要发生在可溶态，提示修复机制与细胞周期进程耦合。

4. 磷酸化调控DHX9滞留动力学：活细胞成像显示S321A突变体虽能被招募至DSB位点，但无法稳定滞留；而S321E突变体滞留能力与野生型相当，证实磷酸化是滞留的关键开关。

5. 动态磷酸化平衡决定修复效率：中性彗星实验发现，S321A和S321E突变均导致DSB修复缺陷。机制上，持续磷酸化(S321E)会削弱DHX9与BRCA1的互作，影响BRCA1病灶形成，进而阻碍DNA末端切除。

这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究首次阐明：ATM-DHX9磷酸化轴通过"磷酸化滞留-去磷酸化互作"的时序调控机制，精确协调HR修复进程。S321磷酸化如同分子开关，先促进DHX9在损伤位点锚定，随后必须适时解除以允许BRCA1募集，这种动态平衡的打破（如癌症中DHX9过表达）可能导致修复异常。

研究创新性地将DHX9的细胞周期特异性修饰、亚细胞定位与功能调控相关联，为理解HR修复的精细调控提供了新范式。鉴于DHX9在肺癌、结直肠癌等多种肿瘤中过表达，针对其磷酸化调控通路的干预，或可成为增强放疗/化疗敏感性的新策略。未来研究可进一步探索：何种磷酸酶负责S321去磷酸化？磷酸化如何改变DHX9的核酸结合特性？这些问题的解答将助力开发更精准的癌症治疗靶点。