基于I-SceI DNA内切酶的无疤痕基因组编辑系统在Cupriavidus necator中的开发与应用

针对酶在工业应用中面临的稳定性差、成本高、回收难等问题，研究人员创新性地利用弹性蛋白样多肽(ELPs)标签的温度响应特性，构建了β-葡萄糖苷酶(Glu)的融合表达体系，实现了一步式分离纯化与固定化。该研究通过优化ELP30,40,50标签长度，使固定化酶的热稳定性提升27.26%-28.05%，为生物催化剂的工业化应用提供了新策略。

　　

在生物催化领域，酶的高效应用长期受制于三大瓶颈：操作稳定性差、纯化成本高昂、回收再利用困难。以β-葡萄糖苷酶(Glu)为例，这种能水解β-D-葡萄糖苷键的关键酶，虽在食品风味改良和生物燃料生产中具有重要价值，但传统多步色谱纯化工艺耗时耗力，而游离酶在工业环境中的脆弱性更令其应用受限。

针对这些挑战，国内某研究机构团队创新性地将目光投向弹性蛋白样多肽(Elastin-like polypeptides, ELPs)——一种由重复五肽序列(VPGXG)_n构成的人工合成多肽。这种材料具有独特的温度响应特性：当环境温度超过其相变点时，ELPs会通过疏水相互作用自发聚集，这种特性既可用于蛋白纯化，又能促进载体吸附。研究人员巧妙地将不同长度(30/40/50重复单元)的ELPs标签与Glu融合表达，开发出集分离、纯化、固定化于一体的新型酶工程系统。

研究采用三大关键技术：1) 基因重组构建pET-Glu-linker-ELP_30,40,50质粒；2) 温度诱导相变纯化技术；3) 疏水载体吸附固定化方法。通过系统优化，团队发现ELP₄₀标签在25℃、1.5M NaCl条件下展现最佳纯化效率，比传统方法缩短60%操作时间。

【Purification and condition optimization】
相变行为分析表明，ELP₅₀标签的临界溶解温度最低(24℃)，而ELP₃₀需升至32℃才发生聚集。这种差异源于重复单元数对疏水性的调控，通过精确控制温度梯度，重组酶纯度可达95%以上。

【Immobilization and characterization】
基于ELPs的疏水特性，团队选用聚苯乙烯微球作为载体，在45℃条件下实现酶的高效固定。固定化Glu在70℃处理1h后仍保留82%活性，较游离酶提高3.5倍；在pH4-9范围内稳定性显著增强，10次循环使用后活性保持90%。

【Synergistic catalysis】
最具突破性的发现是固定化Glu与纤维素酶的协同效应：在羧甲基纤维素(CMC)水解中，糖苷化率提升28.05%。这是由于ELPs介导的定向固定化暴露了酶活性中心，而载体空间位阻的减少促进了底物传质。

这项发表于《Journal of Biotechnology》的研究，首次将ELPs的双重特性(温度响应与疏水作用)创新性地应用于酶工程全流程。其核心价值在于：1) 简化了传统"先纯化后固定"的多步工艺；2) 通过模块化标签设计实现酶性能定制化；3) 为工业酶制剂的低成本生产提供普适性方案。特别值得注意的是，ELP₄₀标签在纯化效率与操作便利性间取得了最佳平衡，这对未来理性设计融合标签具有重要指导意义。正如通讯作者Yun Wang和Juan Han强调的，该技术路线可扩展至其他工业酶系，为绿色生物制造提供新的技术范式。