脱细胞睾丸支架联合精液外泌体协同促进精原干细胞存活与分化的机制研究

本研究针对男性不育治疗中精原干细胞(SSC)移植效率低下的难题，创新性地将脱细胞睾丸支架(DTS)与精液来源的细胞外囊泡(SEVs)相结合，构建了仿生睾丸微环境。研究人员通过组织工程学方法证实，SEVs负载的DTS能显著提升SSC存活率并上调DAZL/PIWI基因表达，为无精症患者的生育力恢复提供了新型联合治疗策略。该成果发表于《BioMedical Engineering OnLine》，为生殖医学领域组织工程技术的临床应用开辟了新途径。

　　

男性不育已成为影响全球7-10%男性的重大健康问题，其中非梗阻性无精症(NOA)患者因睾丸内精子发生完全停滞，常规辅助生殖技术束手无策。化疗、放疗等医源性因素更使年轻癌症幸存者面临生育能力丧失的困境。精原干细胞(SSC)移植虽具治疗潜力，但移植效率低下、微环境支持不足等瓶颈制约其临床应用。如何重建仿生睾丸微环境，成为生殖医学领域亟待突破的科学难题。

设拉子医科大学组织工程团队创新性地提出"支架-囊泡"协同策略，将保留细胞外基质(ECM)的脱细胞睾丸支架(DTS)与富含生物活性因子的精液外泌体(SEVs)有机结合。研究人员采用三步冻融结合表面活性剂处理法，成功制备出DNA残留<50ng/mg的DTS，组织学证实其完整保留了胶原I型、糖胺聚糖等关键ECM成分。通过超速离心从健康志愿者精液中分离的SEVs，经电镜鉴定为直径42.1±0.1nm的典型外泌体，zeta电位-2.92mV。将含20.5%DBA⁺ SSCs的睾丸细胞接种于SEVs负载支架，10天培养后展现出惊人的生物学效应。

关键技术包括：1)大鼠睾丸脱细胞处理与ECM表征；2)人精浆SEVs分离及PKH26标记示踪；3)新生大鼠睾丸细胞分离及DBA流式分选；4)3D/2D培养体系下MTT活力检测；5)DAZL/PIWI/SCP1基因表达分析。

【Decellularization of rat testis】
冻融循环结合Triton X-100/SLES处理成功清除细胞成分，DNA残留仅24.2±8.4ng/mg，显著低于国际标准。H&E与Hoechst染色证实细胞核完全清除，而Masson染色显示胶原网络完整保留，免疫组化证实胶原I型分布与天然组织一致。

【Characterization of extracellular vesicles】
透射电镜揭示SEVs典型茶托状结构，DLS分析显示其粒径分布均一。PKH26标记实验证实SEVs可被睾丸细胞内化，为旁分泌调控提供可视化证据。

【Cell viability assessment】
MTT实验显示SEVs-DTS组细胞活力显著优于对照组(P<0.001)，培养72小时后光密度值达2D培养组的1.8倍，证实该体系具有优越的生物相容性。

【In vitro assessment】
qPCR检测发现SEVs-DTS组DAZL和PIWI表达量与正常睾丸无统计学差异(P>0.05)，但减数分裂标记SCP1未检测到，提示该系统可支持SSCs存活与早期分化，但未能诱导减数分裂启动。

这项研究首次证实SEVs与DTS的协同作用能显著改善SSCs微环境：支架的三维结构提供物理支撑，而SEVs携带的miRNA和细胞因子则激活PIWI/DAZL通路。尽管未能实现完整减数分裂，但为无精症治疗提供了新思路——通过优化SEVs来源或联合生长因子，有望最终实现体外精子发生。该成果不仅为生殖医学组织工程树立了新范式，其"ECM-外泌体"协同策略更为其他器官再生研究提供了重要借鉴。