基于HgcR转录激活因子的D-2-羟基戊二酸生物传感器开发及其在肿瘤诊断与代谢研究中的应用

本研究针对D-2-羟基戊二酸(D-2-HG)检测的技术瓶颈，开发了新型基因编码生物传感器DHOR。研究人员通过鉴定假单胞菌D-2-HG特异性转录激活因子HgcR，构建了具有1700%荧光响应幅度的比率型传感器，实现了从床旁检测到活细胞成像的多场景应用。该成果发表于《Nature Communications》，为IDH突变相关肿瘤的快速诊断和D-2-HG代谢机制研究提供了强大工具。

　　

在肿瘤代谢研究领域，D-2-羟基戊二酸(D-2-hydroxyglutarate, D-2-HG)作为IDH突变相关肿瘤的关键代谢标志物，其异常积累会通过抑制2-酮戊二酸(2-KG)依赖性双加氧酶活性，导致表观遗传学紊乱和肿瘤发生。然而现有检测技术面临三大困境：质谱分析成本高昂且无法区分D/L型异构体，酶法检测易受样本基质干扰，活细胞内D-2-HG动态监测技术严重匮乏。这些限制阻碍了IDH突变肿瘤的快速诊断和D-2-HG生理病理功能的深入探索。

山东大学微生物技术国家重点实验室的研究团队另辟蹊径，从环境微生物Pseudomonas putida KT2440中发掘出D-2-HG特异性转录调控系统。研究发现该菌株独特的双途径代谢网络：组成型表达的PP5154和HgcR调控的PP4493共同催化D-2-HG氧化，其中HgcR作为LysR型转录调节因子，能特异性识别D-2-HG并激活pp4493表达。基于这一发现，研究人员通过理性设计将circularly permutated yellow fluorescent protein(cpYFP)嵌入HgcR结构域，经多轮优化获得性能卓越的DHOR传感器，其动态检测范围跨越2μM-15mM，对D-2-HG的响应幅度超过1700%。

关键技术方法包括：1）采用AlphaFold3预测蛋白质结构指导传感器设计；2）构建便携式荧光检测装置整合比率型检测算法；3）建立IDH1^R132H突变细胞模型和患者来源胶质瘤样本队列；4）通过Red重组系统和CRISPR-Cas9技术构建微生物代谢工程菌株；5）开发亚细胞定位传感器研究D-2-HG空间分布。

Identification of HgcR as a D-2-HG-specific transcriptional activator
通过比较基因组学发现P. putida KT2440具有双D2HGDH系统，电泳迁移率实验证实HgcR仅与D-2-HG结合后发生构象变化。启动子结合实验显示D-2-HG使HgcR保护区域从48bp缩短至28bp，揭示其调控机制。

Design and characterization of D-2-HG biosensor DHOR
将cpYFP插入HgcR的α7/β4环区获得初始版本DHOR_0.1，引入超折叠位点(S30R/Y39N/N105T/Y145F)使亮度提升376%，最终获得的DHOR传感器K_d值为940μM，量子产率达0.58。分子动力学模拟显示D-2-HG诱导的HgcR二聚化会限制cpsfYFP发色团溶剂可及性。

Portable fluorescence detector for point-of-care D-2-HG testing
集成415/475nm双LED激发系统和CCD光谱仪的便携设备，在21例临床胶质瘤样本检测中与LC-MS/MS结果高度一致(r=0.98)，IDH突变组D-2-HG水平(2.278 μmol/g)显著高于野生型组(0.095 μmol/g)。

Characterization of D-2-HG metabolism and transport in E. coli
发现大肠杆菌YdiJ需同时依赖GlcD和GlpC结构域催化D-2-HG降解，而SerA通过转氢反应生成D-2-HG。鉴定出KgtP为D-2-HG摄入载体，YnfM/DcuC为外排转运体，据此构建的工程菌产量达18.05 g/L。

Spatiotemporal resolution of D-2-HG in HEK293FT cells
线粒体靶向DHOR显示IDH2^R172K突变导致线粒体D-2-HG升高3.2倍，而IDH1^R132H突变主要增加胞质/核内水平。AGI-5198处理使细胞内D-2-HG降低67%，证实传感器可用于抑制剂筛选。

Identifying the roles of human SLC22 family transporters in D-2-HG transport
发现SLC22A13等6个有机阴离子转运体具有双向转运功能，其中SLC22A6在T细胞中高表达，为改善CAR-T细胞在D-2-HG富集微环境的存活提供新靶点。

这项研究实现了D-2-HG检测技术的三大突破：首次开发出适用于活细胞研究的基因编码传感器，创建了成本仅为质谱1/50的床旁检测方案，揭示了微生物到人类的D-2-HG转运保守机制。特别值得注意的是，线粒体D-2-HG的精准测量为理解其亚细胞毒性提供了直接证据，而SLC22转运体的发现为阻断肿瘤-免疫微环境交流提供了干预靶点。研究者建议将PP4493(含Fe-S簇的D2HGDH)与HgcR调控模块整合到CAR-T细胞，构建能感知并清除D-2-HG的智能回路，这为代谢干预型肿瘤免疫治疗开辟了新思路。