基于回文序列设计的"单瓣双功能"与"双酶四循环"纳米信号放大系统实现FEN1的定制化检测

针对癌症早期诊断中FEN1（Flap endonuclease 1）生物标志物检测灵敏度不足的难题，研究人员开发了基于回文序列设计的"单瓣双功能"与"双酶四循环"纳米信号放大系统。该方法仅需两种DNA底物和一对酶即可实现3.5×10-6 U/mL的超灵敏检测，通过DNA模板化铜纳米颗粒（CuNPs）实现无标记信号转导，为癌症分子诊断提供了新策略。

　　

在癌症分子诊断领域，Flap endonuclease 1（FEN1）作为DNA复制修复过程中的关键核酸酶，其异常表达与乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤密切相关。然而传统检测方法如Western blotting和ELISA面临操作复杂、灵敏度不足的瓶颈，难以满足早期癌症诊断需求。尤其当面对痕量FEN1时，现有荧光标记技术还存在信号转导效率低、成本高等问题。

针对这一挑战，来自中国的研究团队在《Talanta》发表创新成果，开发了基于回文序列设计的超灵敏检测系统。该研究巧妙融合"单瓣双功能"（single-flap-double-duties）与"双酶四循环"（dual-enzymes-quadruple-cycles）两大技术模块，仅需两种DNA底物和Klenow片段、Nt.BbvCI两种酶，即可实现FEN1活性的指数级信号放大。通过DNA模板化铜纳米颗粒（CuNPs）的无标记检测方式，最终达到3.5×10^-6 U/mL的检测限，成功区分癌细胞与正常细胞。

关键技术包括：1）回文序列分区的哑铃型DNA探针设计；2）FEN1特异性触发5'端悬垂瓣（flap）切割；3）聚合酶-核酸酶驱动的四重等温扩增循环；4）DNA-CuNPs荧光信号转导。这些技术突破使检测过程可在单管内完成，兼具高灵敏度与操作简便性。

【设计原理】
研究人员将回文序列拆分为两部分：5'端悬垂瓣（I区）作为FEN1响应开关，互补序列（II区）则用于启动扩增。当FEN1存在时，特异性切割I区释放触发链，进而激活后续扩级联反应。这种"单瓣双功能"设计同时实现了信号激活与背景抑制的双重控制。

【信号放大】
通过引入回文发夹结构，系统在聚合酶（Klenow）和切口酶（Nt.BbvCI）协同作用下形成四重扩增循环。每个FEN1分子可产生大量短DNA片段，这些产物作为模板合成高荧光强度的CuNPs，实现信号指数放大。

【性能验证】
该方法对FEN1的检测线性范围跨越5个数量级，最低检测限达3.5×10^-6 U/mL，较现有技术提升2-3个数量级。在细胞裂解液测试中，能清晰区分癌细胞与正常细胞，且不受其他核酸酶干扰，证实其临床应用潜力。

这项研究的意义在于：首先，通过模块化设计简化了检测体系，仅用两种DNA底物即实现复杂功能；其次，将酶级联反应与纳米材料信号转导创新结合，为生物标志物检测提供了新范式；最重要的是，其超高灵敏度为癌症早期诊断提供了可能。研究者Yu Yang、Yali Liu等提出的"双酶四循环"概念，不仅适用于FEN1检测，还可拓展至其他核酸酶标志物分析领域，展现出广阔的转化应用前景。