狂犬病毒糖蛋白工程化改造：提升稳定性和表达水平以优化疫苗设计

研究人员针对当前狂犬病疫苗需多次接种且成本高的问题，聚焦狂犬病毒糖蛋白（RVG）进行结构导向工程改造，通过启动子优化、共表达基质蛋白（RVM）及72种突变体筛选，发现H270P/H419L等突变可增强RVG预融合稳定性，但腺病毒载体和mRNA疫苗的动物实验显示突变体未显著提升免疫原性。该研究为蛋白亚单位疫苗开发提供了新思路，同时提示预融合稳定化策略的抗原依赖性。

　　

狂犬病仍是全球公共卫生威胁，每年导致约5.5万人死亡，主要分布在亚非地区。尽管已有疫苗，但需多次接种（2-5剂）和高成本限制了可及性。狂犬病毒糖蛋白（Rabies virus glycoprotein, RVG）是中和抗体的主要靶点，但其构象动态变化（预融合与后融合状态）可能影响疫苗效果。牛津大学（University of Oxford）的研究团队通过多策略工程化改造RVG，探索提升疫苗效力的新路径。

研究采用启动子比较（LPTOS/CASI/Short）、共表达RVM、C端三聚化结构域插入等方法优化野生型RVG表达；基于预融合结构模型设计7类72种突变体，通过流式细胞术和ELISA筛选酸稳定性（pH 5.8 vs 7.3）和表达水平。关键实验技术包括：Expi293F细胞瞬时转染、AlexaFluor 647标记的RVC20单抗（靶向预融合构象）染色、ChAdOx2腺病毒载体构建、脂质纳米颗粒（LNP）封装mRNA疫苗，以及小鼠免疫原性评价（ELISA和病毒中和试验RFFIT/FAVN）。

3.1 野生型RVG构建体的特性分析
启动子优化显示LPTOS与CASI表达水平相当，密码子优化的PVoG RVG表达量提升但未转化为免疫优势。插入三聚化结构域（如Fibritin foldon）显著降低表达，而双抗原（RVG+RVM）构建体中F2A肽设计削弱RVG表达。腺病毒载体免疫小鼠实验证实，所有改造均未超越野生型RVG的免疫原性。

3.2 靶向突变增强RVG表达与预融合稳定性
通过同源建模和Rosetta设计，筛选出H270P（破坏后融合螺旋）和H419L（潜在pH传感位点）等关键突变。单突变体H270P使酸稳定性比（MFI_Acid/MFI_Neut）从0.2提升至0.5，双突变体H270P_H419L进一步达0.8。L271Q_H419L则显著增强表达水平（较野生型提高1.8倍）。

3.3 组合突变未改善mRNA疫苗效果
在0.2 μg剂量（剂量反应曲线陡峭区）的mRNA-LNP疫苗实验中，H270P、H270P_H419L和L271Q_H419L均未显著提升中和抗体（VNA）或总IgG滴度。VNA与IgG比值分析显示突变体与野生型无统计学差异。

研究表明，尽管结构改造在体外可增强RVG稳定性和表达，但腺病毒和mRNA疫苗平台中，野生型RVG已能提供最优免疫原性。这提示预融合稳定化策略的效果可能因抗原特性（如RVG的III类融合蛋白属性）和递送系统而异。该成果为蛋白亚单位疫苗生产提供了高表达突变体（如L271Q_H419L），同时强调了对不同疫苗平台进行实证评估的必要性。研究数据发表于《Vaccine》，为狂犬病疫苗优化提供了重要参考。