单细胞转录组学揭示体内外软骨细胞分化动态：FOXO1通路调控软骨形成的新机制

本研究针对软骨组织工程中存在的细胞状态异质性和体外分化偏离体内发育轨迹等关键问题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和原位测序技术构建了人类软骨内成骨过程的细胞图谱。研究团队比较分析了多种体外软骨形成方案，发现FOXO1转录因子在胚胎成骨细胞和体外培养细胞中异常活跃，通过抑制该通路显著提高了体外软骨细胞标志基因的表达。该研究为优化软骨组织工程提供了重要参考框架，对肌肉骨骼疾病建模和再生医学具有重要价值。相关成果发表在《Developmental Cell》期刊。

　　

软骨组织工程领域长期面临重大挑战：体外培养的软骨细胞往往呈现异质性状态，与体内天然软骨细胞存在显著差异。这些问题严重制约了软骨疾病模型构建和再生医学应用。目前，虽然已有多种体外软骨分化方案，但由于缺乏与人类胚胎组织的直接比较标准，难以准确评估这些方案的可靠性。此外，干细胞在分化过程中易产生非目标转录，软骨细胞在培养中容易去分化，这些问题都亟待解决。

Wellcome Sanger Institute的研究团队在《Developmental Cell》发表重要研究成果，通过单细胞和空间转录组技术揭示了人类软骨内成骨过程的细胞动态变化。研究人员首先构建了5-17孕周人类胚胎肢体的单细胞图谱，包含249,151个细胞，通过与原位测序数据整合，精确定位了不同细胞类型的空间分布。随后，他们利用这一参考图谱评估了多种体外软骨形成方案，发现这些方案产生的细胞状态存在显著异质性。通过单核RNA测序和轨迹比对，研究人员识别出体外分化过程中的偏离特征，并确定FOXO1是调控这一过程的关键因子。实验证实，抑制FOXO1可显著提高软骨形成相关基因的表达水平。

研究采用了多项关键技术：1)对18个胚胎长骨样本进行scRNA-seq，结合公共数据构建软骨内成骨图谱；2)使用90基因panel进行原位测序(ISS)，确定细胞空间定位；3)对体外培养的153,524个细胞核进行snRNA-seq；4)应用Genes2Genes算法比对体内外分化轨迹；5)使用AS1842856(AS18)抑制剂靶向调控FOXO1通路。

研究结果部分，"Endochondral ossification at single-cell resolution"显示，团队成功鉴定了从PRRX1⁺TWIST1⁺FOXP1/2⁺软骨祖细胞到SOX9⁺COL2A1⁺软骨细胞的完整分化轨迹，包括早期静息软骨细胞、静息软骨细胞、增殖软骨细胞、前肥大软骨细胞和肥大软骨细胞等6个亚群。特别值得注意的是，研究人员发现MPZ(外周髓鞘蛋白)在肢体原基中表达，提示雪旺细胞前体可能参与软骨形成。

"TF networks through endochondral ossification"部分揭示了软骨形成过程中的关键转录调控网络。SOX9从静息软骨细胞阶段开始持续活跃，KLF4调控基质相关基因表达。研究发现HOX11基因家族成员呈现细胞类型特异性活性：HOXC11在静息和增殖细胞中活跃，而HOXA11和HOXD11在前肥大和肥大细胞中活跃。在骨系细胞中，RUNX2仅在骨膜细胞中预测有活性，而FOXO1在早期和成熟成骨细胞中显示强活性。

"Using embryonic skeletogenesis to benchmark in vitro chondrogenesis protocols"部分评估了6种体外方案。研究发现，hESC来源的方案在第14天后显示向肥大软骨细胞转变，同时异常表达成骨细胞标志物(ALPL、SPP1、IBSP等)。而iPSC方案则显示PRG4(蛋白聚糖4)表达增加，更接近关节软骨特征。

"Chondrocyte differentiation dynamics in vivo and in vitro"通过轨迹比对发现，体外培养细胞与胚胎软骨细胞在53%的高变基因上表现一致，关键软骨形成转录因子(SOX6、SOX9、KLF2、KLF4等)的活性高度保守。但体外细胞异常表达ACTA2(平滑肌肌动蛋白)、THBS2(血小板反应蛋白2)等非目标基因。

研究结论指出，这项工作为利用人类发育数据推进软骨组织工程提供了概念验证。通过靶向抑制FOXO1，研究人员成功提高了体外软骨细胞的纯度。研究建立的评估框架可用于优化培养方案，使体外细胞更接近天然状态。该成果对肌肉骨骼疾病建模具有重要意义，特别是作为全球致残首因的骨关节炎治疗。研究还发现，不同培养条件可产生肥大软骨或关节软骨两种表型，为针对不同疾病需求定制化培养方案提供了可能。

研究也存在一定局限性：由于样本获取限制，未能分析肢芽早期或孕17周后的发育阶段；基质丰富组织的解离困难导致肥大软骨细胞捕获不足；体外培养的分化速率存在批次差异等。未来研究可通过更频繁采样、蛋白水平验证等进一步完善。这项工作的真正价值在于建立了一个发展生物学指导组织工程的新范式，这一思路可推广至其他组织系统的体外构建。