冷冻电镜与冷冻电子断层扫描揭示分枝杆菌噬菌体Douge的分子结构及宿主互作机制

本研究通过冷冻电镜(cryo-EM)和冷冻电子断层扫描(cryo-ET)技术，首次解析了分枝杆菌噬菌体Douge的原子分辨率全结构，揭示其由1,105个蛋白亚基组成的独特分子架构。研究人员发现其衣壳表面分布952个糖结合域，特异性识别分枝杆菌表面脂阿拉伯甘露聚糖(LAM/AM)，并通过纳米级成像捕捉到噬菌体感染宿主(Mycobacterium smegmatis)的动态过程。该研究为基于结构的噬菌体工程改造提供了重要理论基础，对开发抗结核病新型疗法具有重要意义。

　　

在抗微生物耐药性日益严峻的背景下，噬菌体疗法成为对抗耐药结核分枝杆菌的新希望。然而，分枝杆菌噬菌体的分子结构与宿主互作机制长期缺乏高分辨率研究，这严重限制了通过理性设计改造噬菌体的可能性。目前仅有两种分枝杆菌噬菌体的完整结构被解析，且对它们如何识别复杂的分枝杆菌细胞壁糖类结构仍知之甚少。中国科学院生物化学研究所的研究团队在《Cell Reports》发表的研究，首次以原子分辨率揭示了分枝杆菌噬菌体Douge的完整结构及其与宿主的动态互作过程。

研究采用冷冻电镜单颗粒分析、冷冻电子断层扫描和糖芯片技术三大关键技术。通过优化样品制备条件获得高质量的噬菌体颗粒，利用对称性局域重构策略克服了噬菌体尾部柔性问题，结合糖芯片筛选鉴定了表面蛋白的糖结合特异性，最后通过时间分辨冷冻电子断层扫描捕捉了感染过程的动态构象变化。

Cryo-EM结构揭示Douge的分子架构
研究解析了Douge噬菌体400 nm全长的原子结构，发现其由13种蛋白质的1,105个亚基组成。衣壳呈现T=9二十面体对称性，包含535个主要衣壳蛋白(MCP)和120个衣壳水泥蛋白(CCP)。独特的CCP二聚体位于二十面体平面的C-hexon和P-hexon界面，通过16.4°的取向差异实现对称性适配。

不对称的衣壳-门户连接器界面
连接器区域显示出门户蛋白(dodecamer)与衣壳顶点(pentamer)的12:5对称性错配。冷冻电镜密度图显示，门户蛋白的α1螺旋和β7-β8变形环与适配器蛋白的C端臂形成紧密相互作用，这种独特的界面结构可能参与基因组释放的调控。

糖结合域的特异性分布
研究发现衣壳和尾管表面的919个免疫球蛋白(Ig)样结构域能特异性结合分枝杆菌表面糖类。通过重组表达和糖芯片分析，确认这些结构域优先识别分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和α-葡聚糖片段。基因敲除实验显示，缺失表面阿拉伯甘露聚糖(AM)的宿主菌株吸附效率降低67%，证实糖结合域在宿主识别中的关键作用。

冷冻电子断层扫描捕捉感染动态
纳米级分辨率成像揭示了Douge以"平行"和"直立"两种取向接触宿主细胞。通过分析576个噬菌体-宿主互作事件，研究人员重构出六个感染阶段：1)中央纤维不可逆吸附；2)穿透外膜；3)基板保持附着；4)形成3.7 nm穿孔；5)基因组喷射启动；6)空衣壳保持连接。特别发现基板在基因组喷射过程中始终锚定在外膜上，而测量蛋白(TMP)可能形成跨膜通道保护病毒DNA。

这项研究首次在原子尺度描绘了分枝杆菌噬菌体的完整结构蓝图，阐明了其通过多价糖结合域高效识别宿主的分子机制。所发现的糖结合特异性为改造噬菌体宿主范围提供了明确靶点，而基因组门控系统的发现为理解Siphophage科噬菌体的感染机制提供了新范式。这些突破性发现将加速针对结核分枝杆菌等病原体的噬菌体疗法开发，对解决全球抗微生物耐药危机具有重要战略意义。