跨界T6SS效应蛋白TseR：一种靶向原核与真核细胞的双功能RNase毒力因子

本研究首次报道了假结核耶尔森菌（Yptb）T6SS-3分泌的Ntox44家族RNase效应蛋白TseR，该蛋白通过其核糖核酸酶活性介导接触依赖/非依赖的细菌竞争，并通过改变肠道菌群和直接靶向宿主细胞RNA促进病原体定植与致病。研究揭示了T6SS RNase效应蛋白在细菌间竞争和宿主-病原体互作中的双重功能机制。

　　

TseR的发现与分泌机制
研究团队在假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis, Yptb）T6SS-3基因簇中发现了一个含有PAAR结构域和Ntox44结构域的新型效应蛋白YPK_2589（命名为TseR）。Western blot实验证实TseR的分泌严格依赖T6SS-3组分ClpV3，在ΔclpV3和Δ4clpV突变体中完全丧失分泌能力。通过构建系列缺失突变体，研究人员首次明确了Ntox44家族蛋白的分泌途径。

RNase活性的生化特征
重组表达的MBP-TseR蛋白在体外实验中展现出显著的RNA水解活性：能完全降解23S/16S rRNA，部分降解tRNA，但对DNA无作用。通过5'-FAM标记的RNA底物实验，发现TseR优先切割单链RNA区域，且对"A"、"C"、"U"碱基表现出位点偏好性。酶学分析表明TseR是二价金属离子依赖型RNase，最适反应条件为pH7.5、37°C，Mn²⁺和Na⁺能显著增强其活性。关键残基突变体TseR^Y139A/I140A完全丧失酶活性和细菌毒性。

双模式细菌竞争机制
竞争实验揭示了TseR独特的双重作用模式：在接触依赖的细菌竞争中，野生型Yptb对ΔtseRΔtseR受体菌显示出2.4倍生长优势；令人惊讶的是，通过半透膜分隔的接触非依赖系统中同样观察到类似竞争表型。荧光标记实验证实TseR能通过外膜孔蛋白OmpC进入大肠杆菌，而ΔompC突变体则完全抵抗TseR毒性。RNA-seq鉴定出219个TseR切割位点，主要富集于ABC转运、氨基酸代谢等关键通路，解释了其广谱抗菌活性。值得注意的是，TseR还能有效抑制革兰氏阳性菌Corynebacterium glutamicum的生长。

肠道微生态调控作用
动物实验显示，ΔtseR和ΔclpV3突变株的致病力显著降低，小鼠存活率提高。16S rRNA测序发现TseR能特异性减少肠道中Bacillota和Verrucomicrobiota的相对丰度，尤其显著抑制具有抗炎作用的Akkermansia和Clostridium_XVIII菌属，同时促进致病性Enterococcus和Escherichia/Shigella的增殖。这种菌群紊乱与肠道屏障破坏直接相关，组织病理学观察到野生型感染组出现严重的绒毛结构异常和炎症浸润。

跨界靶向宿主细胞
在抗生素清除菌群的模型中，TseR仍能增强Yptb致病性，提示其直接宿主毒性。TEM-1β-内酰胺酶报告系统证实TseR能被T6SS转运至HeLa细胞。MTT和流式细胞术显示TseR诱导宿主细胞凋亡，且依赖其RNase活性——互补野生型tseR能恢复细胞毒性，而酶活突变体则不能。TUNEL实验进一步证实，TseR能显著增加感染小鼠肠上皮细胞的DNA断裂。体外实验表明TseR可有效降解真核生物28S/18S rRNA，揭示了其跨界毒性的分子基础。

研究意义与展望
该研究首次阐明了Ntox44家族蛋白的生物学功能，拓展了对T6SS效应蛋白多样性的认知。TseR作为罕见的跨界RNase效应蛋白，其双功能特性为理解病原菌适应多宿主环境的进化策略提供了新视角。未来研究可聚焦于：TseR在其它微生物中的同源蛋白功能验证、宿主细胞RNA靶标特异性识别机制、以及基于TsiR免疫蛋白的潜在抗菌策略开发。这些发现不仅为细菌致病机制研究提供新模式，也为相关感染性疾病的防治提供了新靶点。