DNA聚合酶δ介导的重组偶联DNA合成在减数分裂交叉与非交叉形成中的关键作用

本研究针对减数分裂DSB修复过程中3'端ssDNA局部合成机制不明确的问题，通过酿酒酵母模型系统，结合物理分析、胸苷类似物标记和超分辨显微成像技术，首次揭示了DNA聚合酶δ(Polδ)通过末端引发合成活性延伸初始D-loop，促进双霍利迪连接体(dHJ)和非交叉(NCO)形成的分子机制。该研究阐明了重组偶联DNA合成(MRDS)在减数分裂后入侵步骤中的核心作用，为理解同源染色体精确配对和遗传多样性产生提供了新视角。

　　

在生命延续的奥秘中，减数分裂扮演着核心角色，它通过同源重组创造遗传多样性，确保染色体正确分离。然而，这个精密过程仍有许多未解之谜——特别是当DNA双链断裂(DSB)发生后，3'端单链DNA(ssDNA)如何通过局部合成完成修复？这个关键步骤直接影响着交叉(CO)和非交叉(NCO)的形成效率，但具体机制一直模糊不清。

中央大学（Chung-Ang University）生命科学系的Hyungseok Choi和Jun Seo Lee等研究人员在《Nucleic Acids Research》发表的重要研究，首次系统揭示了DNA聚合酶δ(Polδ)在减数分裂重组偶联DNA合成(MRDS)中的核心作用。通过酿酒酵母模型，研究团队发现Polδ通过其末端引发合成活性延伸初始D-loop结构，不仅促进双霍利迪连接体(dHJ)形成，还调控非交叉重组事件。这一发现填补了从单端入侵(SEI)到成熟重组产物形成的关键知识空白，为理解减数分裂中遗传物质交换的分子基础提供了全新视角。

研究采用四大关键技术：1)同步减数分裂时间进程分析系统追踪重组动态；2)胸苷类似物(BrdU/EdU)标记结合免疫荧光检测MRDS活性；3)二维凝胶电泳物理分析重组中间体(SEI/dHJ)；4)超分辨结构光照明显微镜(N-SIM)观察RPA-ssDNA filaments空间分布。通过构建POL3-CM(羧基端标签)和POL3-AID(辅助素诱导降解)突变体，研究团队实现了对Polδ功能的精确调控。

DNA Polδ是形成dHJs的必要条件
通过分析HIS4LEU2热点位点的重组中间体，研究发现Polδ功能缺陷导致dHJ水平显著降低（WT 1.36% vs POL3-CM 0.21%），而SEI形成不受影响。这种特异性缺陷在CYS3、BUD23、ERG1和ARG4等多个天然DSB热点位点得到验证。相比之下，DNA聚合酶ε(Polε)的缺失不影响SEI-dHJ转换，表明Polδ在减数分裂后入侵步骤中具有独特功能。

Polδ活性促进SEI向dHJ转变
时序分析显示Polδ突变体中SEI:dHJ比值异常升高，表明MRDS受阻主要发生在SEI成熟阶段。研究者提出"末端引发合成"模型：Polδ通过延伸入侵链3'端，产生足够长度的新生ssDNA，为第二DSB末端的捕获创造条件。这一过程对CO和NCO通路都至关重要，但在ZMM依赖的CO指定过程中，Zip3定位和联会复合体形成不受MRDS影响。

POL3突变体表现出减数分裂灾难和重组缺陷
遗传分析揭示Polδ功能缺陷导致孢子存活率显著下降（POL3-CM 72.2%，POL3-AID +IAA 0%），并伴随异常核分裂现象。物理检测显示CO和NCO产物分别减少至野生型的61%和16%，证实MRDS效率直接影响遗传重组结局。值得注意的是，Polδ缺陷引发DSB末端过度切除，形成异常的RPA-ssDNA长丝状结构。

MRDS由DNA Polδ在酵母染色体DNA中执行
通过HSV-TK/hENT1系统实现的BrdU标记显示，WT在减数分裂期(3-6h)出现明显的MRDS信号，而pol3突变体中该信号显著减弱。EdU标记实验进一步证实，Polδ介导的DNA合成特异地发生在偶联重组的染色体区域，与前期复制(0-2h)信号明显区分。

RPA-ssDNA filaments在pachytene染色体上积累
超分辨成像发现pol3突变体中RPA foci数量异常增加（WT 39.4 vs POL3-AID +IAA 122.7），且呈现从染色体轴向突出的"倒刺状"分布。这些滞留的RPA-ssDNA结构表明，缺乏Polδ介导的MRDS会导致重组中间体无法正常解离，阻碍DSB修复完成。

CO指定与SC nucleation独立于DNA合成发生
尽管Polδ缺陷严重影响dHJ形成，但Zip3焦点数量（~40个/细胞）和联会复合体组装基本正常。共定位分析显示Polδ与Zip3在38.7%的CO位点共现，证实MRDS发生在CO指定之后，主要参与后期执行阶段。

Polδ支持Rad52介导的第二末端捕获
通过构建RAD52-AID POL3-CM双突变体，研究发现Rad52与Polδ在功能上存在级联关系：Polδ介导的第一末端延伸为Rad52促进的第二末端捕获创造条件。两者协同确保重组中间体向成熟产物发展。

这项研究确立了DNA Polδ在减数分裂重组中的核心地位：通过MRDS机制延伸入侵链，Polδ不仅促进dHJ形成，还保障SDSA途径的NCO产生。这种精确调控体现在三个层面：1)时空上，MRDS特异地发生在减数分裂前期I的zygotene-pachytene转换期；2)机制上，末端引发合成确保新生链与模板链的精确配对；3)功能上，与Rad52/RPA形成有序的工作流程。该发现为理解染色体稳定性维持和遗传多样性产生的分子基础提供了新范式，对生殖生物学和遗传疾病研究具有重要启示意义。