优化启动子、载体骨架和His标签位置显著提升谷氨酸棒杆菌中超嗜热菌Pyrococcus furiosus β-葡萄糖苷酶的表达效率

本研究针对大肠杆菌表达系统存在的安全隐患问题，通过优化启动子（Ptrc）、载体骨架（pHCP）和His标签位置，首次在谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）中实现超嗜热菌Pyrococcus furiosus β-葡萄糖苷酶（PfBGL）的高效表达，产量提升15倍，催化效率（kcat/Km）提高23%，为食品医药领域提供了更安全的酶生产平台。

　　

在生物燃料、食品和制药行业中，β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）因其能够水解β-糖苷键释放葡萄糖而具有重要价值。其中，来自超嗜热古菌Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶（PfBGL）因其卓越的热稳定性和广泛的底物特异性，成为工业应用的理想选择。然而，传统的大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统存在内毒素等安全隐患，限制了其在食品和医药领域的应用。因此，寻找一种更安全、高效的替代表达宿主成为当务之急。

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为一种"公认安全"（GRAS）的革兰氏阳性菌，因其低内毒素产量和多样的碳源利用能力，逐渐成为重组蛋白表达的新宠。然而，该宿主系统常面临蛋白产量低的瓶颈，且此前从未实现PfBGL的成功表达。针对这一挑战，来自韩国的研究人员在《Enzyme and Microbial Technology》发表了一项突破性研究。

研究团队采用了多管齐下的策略：首先测试了四种不同启动子系统的表达效率；其次比较了不同载体骨架对蛋白产量的影响；最后创新性地探索了His标签位置对酶活性和稳定性的影响。值得注意的是，实验使用的C. glutamicum ATCC 13032菌株和pEC-XK99E质粒均来自标准保藏机构。

【PfBGL soluble expression under various promoters】
研究发现，传统的P_trc-RBS_trc系统无法检测到PfBGL表达。通过启动子优化，P_trc与RBS_T7的组合展现出最佳表达效果，这提示核糖体结合位点（RBS）的选择对C. glutamicum中的蛋白表达至关重要。

【Vector backbone optimization】
在确定最佳启动子系统后，研究人员发现pHCP载体骨架相较于其他测试载体能显著提高PfBGL产量，说明载体骨架的优化是提升异源表达效率的关键因素之一。

【Effect of His-tag location】
最具突破性的发现是His标签位置的双重效应：N端标记不仅使蛋白表达量提高15倍，还将催化效率（k_cat/K_m）提升23%，且不影响酶的热稳定性。这为蛋白工程提供了新思路——标签位置可能影响蛋白折叠和功能。

【Conclusion】
该研究首次在C. glutamicum中实现了PfBGL的高效表达，通过多层次的优化策略（启动子、载体骨架和His标签位置）解决了这一安全宿主系统中蛋白产量低的共性问题。特别值得注意的是，N端His标签的"一箭双雕"效应——既提高表达量又增强酶活性，这一发现可能颠覆传统的C端标签惯例。

这项研究的科学价值在于：为食品医药行业提供了更安全的酶生产平台；建立了C. glutamicum高效表达系统的优化范式；揭示了蛋白标签位置对表达和功能的双重影响。正如通讯作者Ki Jun Jeong和Jin Ryoun Kim强调的，这种"简单而有效"的优化策略可推广至其他重要工业酶的生产，具有广阔的产业化应用前景。