构建Haloferax mediterranei基因组尺度代谢模型iHM951优化PHBV合成

为解决传统石油基塑料污染问题，研究人员通过构建首个Haloferax mediterranei基因组尺度代谢模型iHM951（含1862个反应和1827个代谢物），结合13C-MFA和RNA-seq技术，发现三磷酸异构酶（TpiA）是调控PHBV合成的关键靶点，过表达tpiA使生物量提升26%、PHBV产量增加47%，为嗜盐古菌的理性代谢工程提供了新范式。

　　

随着全球塑料污染问题日益严峻，开发可替代石油基塑料的生物可降解材料成为当务之急。聚羟基脂肪酸酯（PHA）因其优异的生物相容性和可降解性备受关注，其中共聚物PHBV（聚3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯）因引入3HV单体而具有更佳机械性能。然而，传统PHBV生产菌株面临培养成本高、易污染等问题。极端嗜盐古菌Haloferax mediterranei因其独特的耐高盐特性（可在150 g/L NaCl条件下生长），能利用廉价碳源合成PHBV，成为下一代工业生物技术（NGIB）的理想宿主。但古菌遗传操作工具的匮乏，严重制约了其代谢工程改造效率。

中国科学院微生物研究所的研究人员通过构建首个Haloferax mediterranei基因组尺度代谢模型iHM951，系统解析了其代谢网络特征。该模型包含1862个反应、1827个代谢物和951个基因关联，经表型微阵列（PM）和¹³C代谢流分析（¹³C-MFA）验证，准确预测了菌株碳源利用能力和生长速率。研究发现，三磷酸异构酶（triosephosphate isomerase, TpiA）是连接糖酵解、磷酸戊糖途径和PHBV合成的关键节点。通过CRISPR介导的基因编辑技术构建ΔtpiA突变体，证实其缺失会导致生物量下降73%、PHBV产量锐减94%；而利用中等强度启动子P₂₄₂₂过表达tpiA，则使生物量提升26%、PHBV产量增加47%。RNA-seq分析揭示，tpiA过表达显著上调半磷酸化Entner-Doudoroff通路（spED）基因（KDGK和KDGA表达量分别提高3.7倍和2倍）及PHBV合成相关基因（phaB2、phaEC等上调17-21倍），同时抑制TCA循环竞争途径。

关键技术方法包括：1）基于KBase平台构建初始代谢模型，通过BioPython和COBRA工具箱进行反应间隙填补；2）结合表型微阵列（PM）实验验证碳源利用谱；3）采用¹³C标记葡萄糖进行代谢流分析；4）利用pyrF标记系统进行基因敲除和启动子替换；5）通过GC-MS和RNA-seq量化PHBV产量及转录组变化。

研究结果部分：

1. 模型构建与验证
   iHM951模型覆盖23.9%基因组，模拟生长速率（0.045 h^-1）与实验值（0.043 h^-1）高度吻合。¹³C-MFA显示>90%葡萄糖碳流经spED通路，乙酰-CoA70%进入TCA循环，60-75%用于PHBV合成。

2. 关键靶点发现
   单基因敲除模拟筛选出106个生长必需基因和6个PHBV合成关键基因，其中tpiA缺失预测使PHBV通量降低79.6%。实验证实ΔtpiA突变体在葡萄糖培养基中PHBV产量下降94%。

3. 代谢工程优化
   过表达tpiA使PHBV单体合成酶phaB2表达上调20倍，PHBV合酶phaEC上调17.8倍，最终菌株pMtpiA的PHBV含量达42.42%（对照38.35%）。

该研究首次将基因组尺度代谢模型应用于嗜盐古菌代谢工程，揭示了TpiA通过协调碳流分配同时促进生物量和PHBV合成的双重作用机制。相比传统细菌PHBV生产系统，H. mediterranei在开放发酵、抗污染和低成本底物利用方面具有显著优势。研究成果发表于《International Journal of Biological Macromolecules》，为开发基于极端微生物的绿色生物制造平台提供了理论框架和技术支撑。未来通过整合酶动力学和调控网络数据，将进一步优化古菌细胞工厂的性能。