非特异性过氧化物酶(UPOs)对木质素单体4-丙基愈创木酚的氧化功能化：结构-功能关系解析与生物催化潜力

本研究针对木质素单体4-丙基愈创木酚(4-PG)的可持续功能化需求，系统评估了19种非特异性过氧化物酶(UPOs)的催化特性。研究人员通过比较分析揭示了UPOs中独特的脂肪族口袋结构与过氧酶活性增强的关联，发现Ascomycota门UPOs对4-PG的转化率>50%且区域选择性优异。该研究为木质素高值化利用提供了新型生物催化剂设计思路。

　　

随着化石资源日益枯竭，木质纤维素生物质作为可再生原料备受关注。木质素作为植物细胞壁三大组分之一，占生物质总量的三分之一，但其高值化利用仍面临巨大挑战。传统化学氧化方法存在选择性差、条件苛刻等问题，而生物催化因其环境友好特性成为研究热点。其中，非特异性过氧化物酶(Unspecific peroxygenases, UPOs)因其仅需H₂O₂作为共底物即可催化多种C-H键氧化反应的特点，展现出独特优势。然而，酚类底物如木质素衍生物易发生非选择性单电子氧化反应，这严重制约了UPOs的工业应用潜力。

挪威生命科学大学(NMBU)的Marta Barros-Reguera团队在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》发表的研究，系统评估了19种来自不同进化分支的UPOs对典型木质素单体4-丙基愈创木酚(4-propylguaiacol, 4-PG)的催化性能。研究人员通过多色底物活性筛选、GC-MS产物分析结合结构比对，揭示了决定UPOs过氧酶/过氧化物酶活性比的关键结构特征。

研究采用的主要技术包括：1)基于7043条序列的UPOs系统发育分析；2)毕赤酵母表达系统实现19种UPOs的重组生产；3)ABTS/2,6-DMP等五色底物活性谱分析；4)GC-MS定量检测4-PG转化产物；5)AlphaFold3结构预测与分子对接模拟。

结构-功能关系解析
通过比较不同进化分支UPOs的催化性能，发现Ascomycota门UPOs(Clade V)对4-PG表现出显著过氧酶活性(产物占比达82%)。结构分析揭示这些酶具有独特的脂肪族口袋(由I73/L77等残基组成)，能稳定底物丙基链并促进其与血红素的近距离接触。

区域选择性调控
产物谱分析鉴定出5种氧化产物：烯丙基化产物1a、O-去甲基化产物1b、环己二烯酮1c、α-羟基化产物1d和间位羟基化产物1e。其中AluUPO和AtuUPO在pH 8.0条件下对1c的选择性高达96%，而AbrUPO-I则偏好催化O-去甲基化反应(61%选择性)。

pH与抗坏血酸效应
抗坏血酸添加使多数UPOs的过氧酶产物得率提升2-3倍，表明其可有效抑制酚自由基偶联副反应。pH影响区域选择性，碱性条件(pH 8.0)促进环氧化(1c)，而酸性条件(pH 3.5-5.5)更利于侧链修饰(1a/1d)。

Clade I特殊案例
尽管大多数Basidiomycota门UPOs(Clade I)以过氧化物酶活性为主，但GmaUPO-II因Phe302导致的狭窄通道结构，意外表现出53%的过氧酶活性，这印证了通道约束性对催化选择性的调控作用。

该研究首次建立了UPOs序列空间与木质素单体氧化性能的功能映射，为设计高性能生物催化剂提供了明确方向。特别是发现Ascomycota门UPOs中保守的脂肪族口袋结构，为后续理性改造提供了关键靶点。这些发现不仅推进了对UPOs自然功能的理解，更为木质素衍生酚类化合物的绿色制造开辟了新途径。通过定向进化或计算机辅助设计进一步优化这些结构特征，有望开发出适用于工业生产的定制化UPOs催化剂。