13C-15N双标记蛋白NACI的偶极相互作用校正及动态学研究：扩散张量与相关时间的精准测定

本研究针对15N/13C双标记蛋白中13C对15N弛豫的额外贡献问题，通过优化15N-13Cα/CO偶极相互作用校正方法，建立了NACI蛋白的扩散张量与整体旋转相关时间（τm=5.0 ns）测定体系。研究发现13C导致R1和R2分别增加3%和2%，该校正方法使r2r1_diffusion程序可直接使用原始数据，但对Fast-Modelfree分析的S2参数影响显著（偏差0.2%-5.9%），为双标记蛋白动态学研究提供重要技术参考。

　　

在蛋白质动态学研究领域，15N核磁共振弛豫测量是揭示分子运动特征的核心手段。然而当研究对象升级为15N/13C双标记蛋白时，13C核与15N之间的偶极相互作用会带来额外的弛豫贡献，这使得传统基于单一15N标记的数据分析方法面临挑战。尤其对于像NACI（眼镜蛇毒液胰凝乳蛋白酶抑制剂）这类含有非天然肽段的复杂体系，精确测定其整体旋转相关时间和各向异性扩散参数变得尤为困难。

台湾中央研究院的研究人员针对这一技术瓶颈开展创新研究。他们选择具有典型性的NACI蛋白作为模型，该蛋白不仅含有与BPTI相似的三对二硫键结构，其C14-C38二硫键周围区域还表现出显著的微秒-毫秒级慢动态行为。通过系统分析15N-13C^α和15N-13CO的偶极相互作用，团队建立了一套完整的弛豫校正方案，相关成果发表在《Journal of Magnetic Resonance》上。

研究主要采用三种关键技术：600 MHz核磁共振谱仪测定R₁、R₂及NOE参数；基于r2r1_diffusion程序进行扩散张量拟合；通过理论计算量化13C对15N弛豫的贡献率。实验样本为大肠杆菌表达的15N/13C双标记NACI蛋白，特别在弛豫测量中施加180° 13C^α/CO脉冲以消除交叉弛豫效应。

【测量范围与相关性验证】
通过分析R₂/R₁比值与理论计算的偏差，首次确定NACI的相关时间τ_m为5.0 ns，显著长于同源蛋白BPTI的3.5 ns。负值R₁^N-C现象证实该蛋白运动特性超出常规预测范围。

【弛豫贡献量化】
精确计算出13C导致的额外弛豫增量：横向弛豫率R₂增加0.124-0.132 s^-1（约2%），纵向弛豫率R₁增加0.057-0.062 s^-1（约3%）。这种残基特异性变化颠覆了既往认为13C贡献恒定的认知。

【方法学验证】
将校正前后的数据分别输入r2r1_diffusion程序比对，扩散张量参数一致性验证了校正方法的可靠性。特别值得注意的是，虽然R₂/R₁比值分析不受13C贡献影响（因3%/2%增幅相互抵消），但Fast-Modelfree程序单独使用R₁、R₂时，S²序参数会出现0.2%-5.9%的正偏差。

【动态特性发现】
在C14-C38二硫键周围区域（S13、C38、G39、G40、N41）检测到显著的构象交换信号，这与温度依赖的弛豫异常及NOE偏差相吻合。该发现为解释Kunitz型抑制剂功能差异提供了动态结构基础。

研究结论部分强调，建立的校正方法在3.5-30 ns相关时间范围和500-800 MHz磁场强度下均保持稳定，13C对R₁/R₂的贡献比例基本不受这些参数影响。对于含长非天然肽段的双标记蛋白，建议将实测R₂^NC/R₁^NC直接用于扩散分析，而对Fast-Modelfree分析则需采用经1.03和1.02系数校正的弛豫数据。该工作不仅解决了双标记蛋白动态学分析的技术难题，更通过NACI的实例揭示了二硫键网络调控蛋白质动态特性的新机制，为理性设计蛋白酶抑制剂提供了重要理论依据。