高通量筛选硝化抑制剂新方法及发现甲状腺肿素作为新型生物硝化抑制剂

推荐：为解决农业氮肥利用率低和环境污染问题，研究人员开发了基于384孔板的高通量筛选方法，可快速鉴定靶向氨单加氧酶(AMO)和羟胺氧化还原酶(HAO)通路的硝化抑制剂，并发现天然化合物甲状腺肿素(goitrin)具有显著抑制活性，为可持续农业提供新工具。

　　

随着全球人口预计在2050年突破90亿，农业氮肥使用量激增导致的环境问题日益严峻。氮肥中的铵态氮(NH₄⁺)通过土壤中氨氧化细菌(AOB)的硝化作用转化为硝态氮(NO₃^-)，不仅造成氮素流失降低肥料利用率，还会产生强效温室气体N₂O和臭氧消耗物质NO。目前欧盟批准使用的硝化抑制剂仅有DMPP、DCD等4种，且存在稳定性差、易产生耐药性等问题。

为解决这一难题，研究人员开发了革命性的高通量筛选平台。该研究建立于384孔板微型化培养体系，仅需50μL细菌培养液即可完成对Nitrosomonas europaea和Nitrosospira multiformis两种关键AOB的抑制活性检测。通过优化培养条件和检测参数，使Z因子(Z')稳定在0.5以上，满足高通量筛选的可靠性要求。研究还创新性地设计了区分AMO和HAO通路抑制剂的检测策略。

关键技术包括：1）建立微型化AOB培养体系；2）开发基于硝态氮检测的384孔板读数系统；3）采用Z因子评估筛选体系稳健性；4）通过底物添加实验区分AMO/HAO作用靶点。

【微生物培养与培育】
使用ATCC 2265和NCIMB 181培养基分别培养N. europaea和N. multiformis，培养基含(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄等成分，在28°C、120rpm条件下振荡培养。

【高通量硝化抑制筛选体系的建立】
通过对比不同孔板密封材料和培养时间，确定最佳实验条件为：使用透气性密封膜，培养时间48小时。阳性对照采用3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)，验证体系可稳定检测≥50%抑制率。

【讨论】
该研究首次实现硝化抑制剂的高通量筛选，发现植物源化合物goitrin对AMO通路具有特异性抑制。相较于传统方法需22mL培养体系，新方法节约99.7%试剂用量，每日可筛选3000个化合物。专利技术(WO2022053660)为新型绿色硝化抑制剂的开发奠定基础。

这项由EuroChem Group AG和FFAR资助的研究，不仅解决了农业氮素管理的技术瓶颈，其建立的HTS平台更为微生物功能研究提供了范式转移。发现的goitrin作为首个植物源生物硝化抑制剂(BNI)，展现出替代化学合成品的巨大潜力，相关成果发表于《Journal of Microbiological Methods》。