CRISPR/Cas9联合内源反向选择标记实现烟曲霉多基因同步整合的技术突破

本研究通过结合CRISPR/Cas9基因编辑技术与内源反向选择标记（fcyB/cntA/azgA），开发了烟曲霉（Aspergillus fumigatus）多基因同步整合系统。该技术解决了传统连续转化耗时耗力的问题，成功实现三报告基因（GFP S65T/Katushka2S/LucOpt）和耐药相关基因（cyp51ATR34/L98H/hapEP88L）的单次转化整合，为真菌遗传工程和抗真菌研究提供了高效平台。

　　

在真菌遗传学研究领域，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）作为重要的人类病原体，其基因操作技术始终面临两大挑战：一是传统连续转化效率低下，二是外源选择标记的有限性会干扰表型分析。尽管CRISPR/Cas9技术已广泛应用于真菌基因编辑，但多基因同步整合仍受制于选择标记的兼容性问题。奥地利因斯布鲁克医科大学（Medical University of Innsbruck）的研究团队创新性地将CRISPR/Cas9与内源反向选择标记系统结合，开发出高效的多基因同步整合策略，相关成果发表于《Journal of Biological Engineering》。

关键技术包括：1）基于Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合体的靶向切割；2）利用嘌呤-嘧啶代谢通路相关基因（fcyB/cntA/azgA）作为反向选择标记；3）通过5-氟胞嘧啶(5FC)/5-氟尿苷(5FUR)/8-氮鸟嘌呤(8AG)三重药物筛选；4）荧光（GFP S65T/Katushka2S）和生物发光（Luc_Opt）报告系统验证。

主要研究结果

内源反向选择标记的拓展验证
通过敲除烟曲霉中嘌呤转运蛋白编码基因azgA，证实其缺失可赋予8AG抗性（图1A），而假定的5FU转运蛋白FurD同源基因敲除未表现表型变化。Southern印迹验证了azgA位点荧光素酶报告基因的正确整合（图S3）。

CRISPR/Cas9辅助的多基因同步整合
在5FC/5FUR/8AG三重选择压力下，传统转化未能获得转化子，而Cas9/sgRNA处理使转化效率提升至平均27个转化子/实验（图3B）。27/28的转化子同时表达三报告基因（图3D），Southern印迹证实5株为单拷贝精准整合（图S5）。

多重耐药菌株的构建与应用
通过50bp微同源臂介导的整合，成功构建携带条件性耐药基因（cyp51A^PxylP/hmg1^Tet-On）和荧光标记（Katushka2S^PgpdA）的菌株（图4A）。多色荧光显微显示，该菌株在诱导条件下的唑类耐药性介于临床分离株cyp51A^TR34/L98H和hapE^P88L之间（图4B-C）。

结论与意义
该研究建立了首个基于内源代谢通路的多基因同步整合系统，其创新性体现在：1）利用非重叠选择标记（fcyB-5FC/cntA-5FUR/azgA-8AG）实现三重筛选；2）通过CRISPR/Cas9将多基因整合效率提升20倍；3）模块化设计支持PCR产物的直接整合。该技术为真菌次级代谢产物合成、耐药机制研究和病原体-宿主互作等领域提供了强大工具，尤其适用于需要引入多遗传特征的复杂实验体系。研究还揭示了嘌呤-嘧啶转运蛋白在药物敏感性中的关键作用，为抗真菌靶点发现提供了新思路。