基于SBD荧光探针的肝型丙酮酸激酶变构配体结合检测新方法开发及应用

本研究针对肝型丙酮酸激酶(PKL)变构位点配体检测的技术瓶颈，设计开发了基于4-磺酰胺基-7-氨基苯并恶二唑(SBD)的荧光探针4a，通过指示剂置换实验成功量化了mitapivat等配体与PKL的相互作用（KD 0.13-2.4 μM），为PKL靶向药物发现提供了高效检测工具。

　　

在能量代谢调控网络中，肝型丙酮酸激酶(PKL)作为糖酵解关键酶，其变构调控机制与代谢相关脂肪肝病(MASLD)、贫血和癌症等多种疾病密切相关。然而，由于PKL存在多个配体结合位点，传统X射线晶体学方法耗时昂贵，且缺乏特异性检测变构位点配体的高效手段，严重制约了靶向药物的开发进程。

针对这一技术瓶颈，研究人员创新性地将环境敏感型荧光团4-磺酰胺基-7-氨基苯并恶二唑(SBD)整合到已知PKL调节剂（如mitapivat和DASA-58）的分子骨架中，设计合成了一系列荧光探针。通过系统优化，获得的探针4a在结合PKL时表现出剂量依赖性荧光增强（EC₅₀ = 1.2 μM），且不受ADP、FBP等天然配体干扰。竞争结合实验测得mitapivat、TEPP-46等临床相关化合物的K_D值分别为0.13±0.02 μM和0.21±0.15 μM，与活性测定结果高度一致。该研究发表于《European Journal of Medicinal Chemistry》，为PKL靶向药物的高通量筛选建立了重要技术平台。

关键技术方法包括：1）基于已知配体结构的理性分子设计；2）荧光光谱法测定探针-蛋白相互作用；3）X射线晶体学解析复合物结构（分辨率最高达PDB 9R3O）；4）动力学GLo酶联法测定配体AC₅₀/IC₅₀；5）HEPG2 PKM2 KO细胞模型验证细胞渗透性。

【2.1 荧光mitapivat探针的设计与评价】
通过分子对接将SBD和丹磺酰荧光团引入mitapivat喹啉环，发现1a虽保持激活活性（AC₅₀ 114±32 μM），但荧光响应较弱，揭示刚性喹啉骨架不利于荧光团环境敏感性的发挥。

【2.2 荧光DASA探针的设计】
基于PDB 7FS8结构，将SBD整合到DASA-58支架中，晶体结构显示4a-4d均能占据变构口袋，其中4b通过水桥与Asn330保持关键氢键，活性提升3倍（AC₅₀ 11±0.4 μM）。

【2.3 生化与荧光特性验证】
仅DMA修饰的4a表现出显著荧光增强，量子化学分析表明氮原子烷基化程度（4a>4d>4c>4b）直接影响扭转分子内电荷转移(TICT)效应，导致荧光响应差异。

【2.4 二羟基苯环结构优化】
引入吡啶环的8a（AC₅₀ 15±1.3 μM）通过Tyr402氢键维持激活活性，而氨基吡啶8b和苯甲酸8c则转变为抑制剂（IC₅₀ 2-4 μM），证实S2亚口袋修饰可调控功能表型。

【2.5 竞争结合实验应用】
4a探针成功量化临床化合物结合亲和力，发现TEPP-46对PKL的活性（AC₅₀ 17±4.1 nM）被严重低估，为重新评估其药理特性提供了实验依据。

该研究不仅建立了首个PKL变构位点特异性检测方法，还通过结构-活性关系(SAR)揭示了荧光响应与分子结构的构效规律。探针4a的高选择性（不受FBP/PEP干扰）和细胞渗透性，为开发PKL靶向治疗药物提供了不可或缺的工具。特别值得注意的是，该技术克服了传统方法无法区分变构位点与其他结合位点的局限，对推动代谢疾病治疗研究具有重要价值。晶体结构揭示的变构口袋特征（如S1/S2亚口袋的空间划分）也为设计新一代PKL调节剂提供了结构基础。