医院废水促进肺炎克雷伯菌携带blaIMP质粒接合转移的转录组学机制研究

本研究揭示了医院废水通过上调接合转移系统基因（如tra系列）、IV型分泌系统（T4SS）基因（virB5/virB8/virB10）及鞭毛相关基因表达，同时增加细菌外膜通透性和活性氧（ROS）水平，显著促进肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）携带blaIMP耐药基因质粒的水平转移（HGT），为临床控制碳青霉烯类耐药基因传播提供新视角。

　　

1 引言
肺炎克雷伯菌作为ESKAPE病原体之一，其携带碳青霉烯酶基因（如bla_IMP）的质粒通过水平转移（HGT）扩散是临床耐药性加剧的关键因素。医院废水含有抗生素、重金属等复杂污染物，可能成为耐药基因传播的"热点"。本研究首次结合转录组学与生理实验，揭示真实医院废水环境对bla_IMP质粒接合转移的促进作用及分子机制。

2 材料与方法
研究采用临床分离的携带IncN_1型bla_IMP质粒的肺炎克雷伯菌为供体菌，以大肠杆菌600为受体菌。通过制备医院废水基质LB培养基（0.22 μm过滤灭菌），比较常规LB与废水LB培养条件下的接合转移频率。结合RNA-seq分析差异基因，同步检测细菌外膜通透性（NPN/PI荧光法）和ROS水平（DCFH-DA探针）。

3 结果
3.1 接合转移增强
废水LB培养基使bla_IMP质粒接合频率提升2倍（P<0.01）。非靶向分析显示废水中含二甲双胍、安赛蜜等已知促进HGT的污染物。

3.2 转录组特征
与常规LB相比，废水培养组差异表达基因达1,415个（上调907个）。GO分析显示羧酸代谢、ABC转运蛋白等通路富集；KEGG提示膜转运与能量代谢重编程。

3.3 关键基因调控
• 接合转移基因：traA/B/C/K等12个tra家族基因显著上调
• T4SS系统：virB5/B8/B10表达量增加3-5倍
• 鞭毛相关基因：gspJ/G/L及fimA等生物膜形成基因激活

3.4 生理机制
• 外膜通透性：废水处理使NPN/PI荧光强度提升2.3倍（P<0.001）
• ROS动态：废水培养菌株KP27的ROS水平持续高于对照组KP21，且对废水刺激更敏感（P<0.05）。硫脲处理证实ROS部分介导该效应。

4 讨论
医院废水通过三重机制促进耐药基因传播：
1）遗传层面：激活tra和virB基因簇，增强接合装置组装效率；
2）结构层面：鞭毛基因上调可能促进细菌聚集形成生物膜微环境；
3）理化层面：ROS爆发导致膜脂过氧化，与ompW/F表达变化协同增加膜通透性。

值得注意的是，废水诱导的代谢重编程（如丙酮酸代谢）可能通过能量供应间接支持接合转移。相比单一污染物研究，真实废水的复合效应更显著，但存在地域和季节波动性。

5 结论
该研究首次证实医院废水作为复杂生态系统，可通过转录重构和氧化应激双重途径加速bla_IMP耐药质粒传播，为"One Health"框架下耐药性防控提供关键实验依据。未来需针对废水成分互作开展机制解析，并开发基于膜通透性调节的干预策略。