外周血γδ T细胞在皮肤和葡萄膜黑色素瘤转移患者中的细胞与分子特征研究

本研究采用超灵敏DNA测序（SiMSen-Seq）和流式细胞术，首次系统分析了皮肤/葡萄膜黑色素瘤转移患者外周血γδ T细胞的受体谱特征。发现Vδ1+亚群在治疗应答者中更富集，且NKG2D在皮肤黑色素瘤患者Vδ2+细胞高表达，为开发非MHC限制性免疫疗法提供了新靶点。

　　

Introduction
γδ T细胞作为T细胞的特殊亚群，其T细胞受体（TCR）由γ和δ链构成，具有不依赖MHC的活化特性。皮肤黑色素瘤在瑞典发病率持续上升，而葡萄膜黑色素瘤虽仅占5%却成为成人最常见眼内肿瘤。尽管免疫检查点抑制剂革新了皮肤黑色素瘤治疗，但对葡萄膜亚型疗效有限，这促使研究者通过SiMSen-Seq技术结合流式细胞术，深入解析两类患者γδ T细胞的δ链受体特征。

Materials and methods
研究纳入14例皮肤黑色素瘤（肢体转移）和14例葡萄膜黑色素瘤（肝转移）患者，所有样本均在局部灌注化疗前采集，并设置13例年龄匹配健康对照。通过磁珠分选富集γδ T细胞后，采用含独特分子标识符（UMIs）的SiMSen-Seq技术对TRD基因CDR3区进行超高灵敏度测序，同时用流式检测NKG2D、CD16等表面标志及胞内细胞因子。

Results

1. 亚群分布特征
   流式显示皮肤黑色素瘤与健康对照的γδ T细胞比例无差异（约7-9%），Vδ1⁺和Vδ2⁺占比相近。但测序发现皮肤黑色素瘤患者非Vδ1/2克隆比例显著增高，且TRDJ1基因占主导（>80%）。

2. 克隆多样性
   皮肤黑色素瘤患者TRD分子总数仅为健康对照的1/4，但克隆型/TRD分子比值更高，尤其治疗无应答者呈现显著高多样性。所有样本均呈现高度寡克隆性，前10个克隆即占据65%以上受体谱。

3. 功能标志物
   皮肤黑色素瘤组Vδ2⁺细胞NKG2D表达显著升高（p<0.05），而CD16、CD161及PMA/离子霉素刺激后的Granzyme B、IFN-γ分泌无组间差异。值得注意的是，合并分析显示应答者的Vδ1⁺克隆有增多趋势（p=0.06）。

4. 受体谱私有性
   热图分析显示各组样本间克隆重叠最大值仅3-4个，表明γδ T细胞受体谱具有高度个体化特征。

Discussion
本研究揭示了黑色素瘤患者γδ T细胞的独特模式：

• 皮肤黑色素瘤患者Vδ2⁺亚群高表达NKG2D，可能增强其对肿瘤细胞的识别能力
• 治疗应答者Vδ1⁺克隆的富集趋势与既往报道的预后相关性吻合
• 超高灵敏度测序发现的"私有受体谱"为个性化免疫治疗提供新思路

技术层面，尽管磁珠分选效率偏低可能影响流式结果，但SiMSen-Seq技术的UMI校正保障了测序数据可靠性。未来需扩大样本验证CMV感染等混杂因素的影响，尤其对缺乏有效疗法的葡萄膜黑色素瘤，靶向γδ T细胞的非MHC限制性策略值得深入探索。