葡萄糖基稀释剂渗透压降低对地中海褐鳟精子冻融后活力的影响：甲醇-乙二醇协同效应的研究

本研究比较了不同渗透压葡萄糖基稀释剂（含甲醇或甲醇-乙二醇组合）对地中海褐鳟（Salmo cettii）精子冻融后活力的影响。实验采用150 mM葡萄糖+7.5%甲醇（150 GM）为对照，测试100/50 mM葡萄糖分别联用甲醇（GM）或甲醇-乙二醇（GMEg）的效果。结果显示，100 GMEg组维持了与对照组相当的活力（65.6±11.6%），但降低曲线速度（VCL 81.5±16.1 μm/s），证实低渗稀释剂（100 mOsm/kg）结合CPA协同作用可有效保存鲑科精子功能，为濒危物种保护提供新策略。

　　

1 引言

地中海褐鳟（Salmo cettii）作为南欧特有鲑科鱼类，因栖息地破坏和基因渗入被列为极危物种。精子冷冻保存技术成为其遗传资源保护的关键手段。传统冷冻稀释剂多采用等渗或高渗环境，但近年研究发现低渗葡萄糖基稀释剂（130-170 mM）能提升鲑科精子冻存效果。更引人注目的是，甲醇与乙二醇的协同作用在鲤科和鲟鱼精子冷冻中展现出突破性优势——通过诱导细胞收缩抑制低渗环境下的精子提前激活。本研究首次将该策略应用于地中海褐鳟，探索降低葡萄糖浓度（100/50 mM）联用不同CPA组合的可行性。

2 材料与方法

实验样本采自意大利比费尔诺河的成年雄性褐鳟（体长31.9±3.2 cm），通过计算机辅助精子分析系统（CASA）评估精子运动参数。设置6组处理：3组葡萄糖浓度（150/100/50 mM）分别联用7.5%甲醇（GM）或7.5%甲醇+2.5%乙二醇（GMEg）。冷冻采用液氮蒸气法（-196°C），解冻后测定运动活力、曲线速度（VCL）等9项动力学指标。渗透压测定显示实际值（2523-3064 mOsm/kg）显著高于理论计算值，反映CPA-溶剂复杂相互作用。

3 结果

新鲜精子展现出89.0±8.4%的总活力和121.2±22.4 μm/s的VCL。传统150 GM组保持最佳冻存效果（总活力65.9±12.9%，VCL 117.6±26.1 μm/s）。突破性发现出现在100 GMEg组——尽管葡萄糖浓度降低33%，仍维持65.6±11.6%的总活力，但VCL显著降至81.5±16.1 μm/s（p<0.05）。50 mM组则完全失效，证实葡萄糖浓度存在临界阈值。渗透压测量揭示含乙二醇组实际值超3000 mOsm/kg，暗示CPA协同可能通过改变溶液微环境发挥保护作用。

4 讨论

低渗葡萄糖环境（100 mM）与甲醇-乙二醇协同的独特机制：
1）葡萄糖提供非离子环境，阻断钾/钙依赖的激活通路；
2）乙二醇增加介质粘度，减缓冰晶损伤；
3）复合CPA通过改变水合层结构稳定细胞膜。VCL下降可能源于乙二醇分子量（62.07 g/mol）大于甲醇（32.04 g/mol），但该参数对人工授精影响有限。研究同时发现理论渗透压计算存在局限，实际测量对方案优化至关重要。

5 结论

首次证实100 mM葡萄糖联用7.5%甲醇+2.5%乙二醇的方案可突破鲑科精子冷冻的渗透压下限，为建立地中海褐鳟精子库提供新范式。后续需通过受精实验验证胚胎发育质量，并探索CPA协同作用对表观遗传的影响。该技术可整合至意大利LIFE Nat.Sal.Mo.等物种恢复计划，对抗日益加剧的环境压力。