基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）与16S/hsp65/rpoB基因桑格测序在非结核分枝杆菌物种鉴定中的比较评估

这篇研究通过比较MALDI-ToF MS与多基因（16S、hsp65、rpoB）桑格测序在59例临床非结核分枝杆菌（NTM）分离株中的鉴定效能，证实多基因串联分析（尤其是16S+rpoB组合）显著提升物种鉴定准确性（Kappa值0.76），为资源有限地区提供了可靠的替代方案。

　　

引言
非结核分枝杆菌（NTM）感染在全球范围内呈上升趋势，其复杂多样的物种特性使得准确鉴定成为临床治疗的关键挑战。传统方法如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）虽被视作金标准，但在资源有限地区普及受限。本研究以59例整形手术患者的NTM分离株为样本，系统评估了桑格测序靶向16S rRNA、hsp65和rpoB基因的鉴定效能，并与MALDI-ToF MS结果对比，为临床诊断提供更灵活的技术选择。

方法学
研究采用改良的Bruker Daltonik蛋白提取法进行MALDI-ToF MS分析，同时通过PCR扩增和桑格测序获取16S（587 bp）、hsp65（393 bp）及rpoB（357 bp）基因片段。系统发育分析采用最大似然法和Tamura 3-参数模型，通过单基因与多基因串联（如16S+rpoB）构建进化树，并利用Cohen’s Kappa系数评估方法间一致性。

结果
单基因分析显示，16S rRNA的物种鉴定率最低（仅8/45株），且与MALDI-ToF MS的加权Kappa值仅0.46，而hsp65（Kappa=0.51）和rpoB（Kappa=0.69）表现更优。值得注意的是，hsp65无法区分M. farcinogenes与M. houstonense，凸显单基因局限性。多基因串联分析显著提升准确性，其中16S+rpoB组合的Kappa值达0.76，甚至优于三基因串联（Kappa=0.72）。此外，rpoB基因可进一步区分M. abscessus亚种（如亚种abscessus），为临床耐药性预测提供潜在价值。

讨论
研究证实，在缺乏MALDI-ToF MS的条件下，串联16S与rpoB的桑格测序策略可作为高性价比替代方案，尤其适用于中低收入国家。这一发现对NTM感染的精准治疗至关重要，例如M. abscessus亚种鉴定可指导大环内酯类（macrolides）用药选择。未来需扩大样本量并纳入更多罕见菌株，以验证方法的普适性。

结论
多基因串联的桑格测序技术为NTM物种鉴定提供了可靠解决方案，其灵活性、成本效益及亚种分辨能力，使其成为全球公共卫生防控体系中不可或缺的工具。