线粒体分裂关键蛋白DNM1L缺失损害人胚胎干细胞功能并激活整合应激反应的机制研究

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建DNM1L基因敲除的人胚胎干细胞（hESCs）模型，首次系统揭示了线粒体分裂关键蛋白DNM1L（DRP1）缺失导致线粒体网络超融合、膜电位下降及氧化应激升高，进而通过激活整合应激反应（ISR）通路（表现为p-eIF2α/ATF4/DDIT3上调）损害hESCs自我更新能力，并特异性影响OCT4表达及早期外胚层分化。该研究为理解DNM1L相关发育障碍疾病提供了干细胞层面的分子机制。

　　

1 引言
多能干细胞（PSCs）的自我更新与分化潜能高度依赖线粒体动态平衡。线粒体通过分裂（fission）和融合（fusion）调控其形态与功能，其中胞质动力蛋白DNM1L（DRP1）是介导线粒体分裂的核心因子。尽管DNM1L缺失在小鼠中导致胚胎致死，但其在人类早期发育中的作用机制尚不明确。本研究通过基因编辑技术构建DNM1L缺陷hESCs模型，旨在解析线粒体分裂障碍对干细胞功能的影响。

2 材料与方法
采用CRISPR/Cas9靶向删除DNM1L第10外显子，构建DNM1L^?/? hESCs，并通过AAVS1位点回补DNM1L cDNA获得拯救细胞系。通过线粒体形态观察（mito-GFP标记）、Seahorse能量代谢分析、流式细胞术检测膜电位（TMRM染色）及ROS水平（CM-H2DCFDA探针），结合qPCR/Western blot评估ISR通路激活状态（p-eIF2α、ATF4等）。分化实验采用特定诱导体系评估三胚层分化潜能。

3 结果
3.1 线粒体结构与功能紊乱
DNM1L^?/? hESCs呈现显著线粒体超融合网络（图1D），伴随mtDNA拷贝数下降（MT-ND1/ND4降低40%，图1E）及膜电位减弱（图2A）。Seahorse分析显示基础呼吸、ATP偶联呼吸和糖酵解（ECAR）均显著受损（图2E-G），提示能量代谢全面崩溃。

3.2 应激反应与自我更新障碍
DNM1L缺失触发ISR通路激活：p-eIF2α水平升高3倍（图3D），下游ATF4、ATF3及自噬相关基因（SQSTM1/p62、DEPP1）显著上调（图3E-F）。表型上，突变体集落直径缩小50%（图3A），增殖速率下降（5天汇合度仅50%，图3B），凋亡率增加（Annexin V⁺细胞达18.6%，图2C-D）。

3.3 多能性调控异常
尽管NANOG表达未受影响，OCT4蛋白水平下降60%（图4B-C）。分化实验揭示早期外胚层标志物（RAX、DLK1）表达受阻（图4D），而内/中胚层分化未受显著影响（图4E-F），表明DNM1L缺失导致谱系特异性分化缺陷。

3.4 基因回补挽救表型
通过AAVS1位点回补DNM1L可恢复线粒体碎片化形态（附图S2C），部分逆转膜电位（附图S3A）及OCT4表达（附图S4D），并下调ISR通路活性（ATF4降低2.5倍，附图S4B），证实表型特异性源于DNM1L功能缺失。

4 讨论
本研究首次揭示DNM1L通过维持线粒体动态平衡保障hESCs能量代谢稳态。线粒体分裂障碍导致电子传递链效率下降，引发氧化应激并激活ISR通路，进而通过ATF4介导的转录重编程抑制OCT4表达。值得注意的是，DNM1L缺失对外胚层分化的选择性影响（图4D）可能与神经嵴发育中线粒体动态变化的特殊需求相关，这为解释DNM1L突变患者神经系统症状提供了新视角。未来研究可聚焦于代谢物（如α-酮戊二酸）在DNM1L缺陷细胞表观遗传调控中的作用，以及ISR抑制剂在疾病模型中的干预潜力。