基于自主研发DNA生物芯片的结核分枝杆菌二线耐药基因突变快速筛查技术研究

本研究针对印度日益严重的耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)结核病防控难题，开发了一种基于聚碳酸酯径迹蚀刻膜(PC-TEM)的DNA生物芯片技术。研究人员通过设计特异性探针检测gyrA、rrs和eis基因突变，实现了对氟喹诺酮类(FQ)和二线注射药物(SLID)耐药性的快速筛查。该技术可在1天内完成检测，灵敏度达75-100%，特异性达96.7-100%，为临床微生物研究和耐药结核病流行病学监测提供了高效工具。

　　

结核病(TB)至今仍是全球最致命的传染病之一，每年导致约125万人死亡。更令人担忧的是，耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的流行率持续攀升，其中印度等发展中国家尤为严重。问题的核心在于二线药物耐药性(SLDR)检测技术的滞后——传统表型药敏试验(DST)需要耗时数周，而WHO推荐的基因型MTBDRsl检测又受限于设备要求。这种诊断延迟不仅耽误治疗时机，更助长了耐药菌株的传播。

位于孟买的巴巴原子研究中心(Bhabha Atomic Research Centre)辐射医学中心联合霍米·巴巴国家研究所的研究团队，在《European Journal of Clinical Microbiology》发表了一项突破性研究。他们创新性地利用聚碳酸酯径迹蚀刻膜(PC-TEM)开发了DNA生物芯片，可同时检测gyrA（氟喹诺酮耐药）、rrs和eis启动子区（二线注射药物耐药）的关键突变。通过不对称多重PCR扩增和化学发光检测技术，实现了250个基因组拷贝/反应的检测灵敏度。

关键技术包括：1)针对112例临床分离株进行表型药敏试验；2)设计覆盖gyrA 90/94密码子、rrs 1401/1484位点和eis启动子突变的特异性探针；3)建立不对称多重PCR体系增强gyrA信号；4)优化PC-TEM膜上的探针固定工艺；5)采用链霉亲和素-过氧化物酶化学发光检测系统。

方法学创新
研究团队首创将PC-TEM应用于结核耐药检测，其多孔结构使探针固定量较平面基质提高10倍。针对gyrA基因设计的非对称PCR方案（反向引物浓度达45 pmol/μl）解决了传统对称PCR信号弱的问题。

突变谱分析
在100例有效样本中，生物芯片检出：

• 12例gyrA突变（9例D94G，3例A90V），与表型DST符合率83.3%
• 22例rrs/eis突变（7例A1401G，6例eis-12T），对SLID的检测灵敏度达90.9%
• 4例罕见双突变（rrs A1401G + eis-12T）

性能验证
与测序结果对比显示：

• 氟喹诺酮检测：氧氟沙星(OFX)灵敏度75%（漏检D94N/G88A突变），左氧氟沙星(LVX)达100%
• SLID检测：卡那霉素/卷曲霉素灵敏度90.9%（漏检T1491C/G1454A突变）
• 特异性方面，仅2例eis-12T突变株出现表型-基因型不符

讨论与展望
该研究首次证实PC-TEM生物芯片在结核耐药检测中的实用价值。相较于需要昂贵设备的荧光微阵列，其化学发光检测方案更适合资源有限地区。值得注意的是，eis-12T突变在2例敏感株中的出现，提示该突变可能不完全决定表型耐药，这与近期关于eis调控区复杂机制的研究相呼应。

局限性在于当前探针组合未能覆盖约15%的罕见突变（如gyrA G88A）。研究人员建议后续可整合首耐药检测芯片，形成完整的XDR-TB诊断方案。这项技术将耐药检测周期从数周缩短至1天，为遏制耐药结核传播提供了关键的技术支撑。