纳米纤维材料上酵母生物膜代谢活性的MTT检测方法优化及其应用研究

本研究针对纳米纤维材料(NMs)在医疗和食品工业应用中易被酵母生物膜定植的问题，首次建立了基于MTT法的酵母生物膜代谢活性检测方案。研究人员系统评估了葡萄糖添加、甲萘醌使用和孵育时间等关键参数，优化出2小时甲萘醌辅助检测方案，并成功应用于白色念珠菌(C. albicans)和酿酒酵母(S. cerevisiae)在聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)和聚酰胺(PA)纳米纤维上的生物膜研究。该协议为探究酵母-NMs相互作用提供了标准化工具，发表于《Folia Microbiologica》。

　　

在医疗植入物和食品包装领域，纳米纤维材料(NMs)因其独特的物理特性被广泛应用，却面临着微生物生物膜污染的严峻挑战。其中，酵母菌形成的生物膜尤为顽固——白色念珠菌(Candida albicans)是医院感染的主要病原体，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)则常导致食品腐败。虽然细菌生物膜研究已较为深入，但针对真核微生物酵母在NMs上代谢活动的检测方法仍存在明显空白。传统菌落计数法无法反映代谢状态，而常用的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)检测在酵母应用中面临细胞壁穿透效率低、信号弱等技术瓶颈。

捷克化学技术大学的研究团队在《Folia Microbiologica》发表创新研究，首次建立了适用于纳米纤维材料的酵母生物膜代谢活性检测体系。通过系统优化MTT法的三个关键参数：能量底物(葡萄糖)补充、电子传递介质(甲萘醌)添加和反应时间控制，开发出稳定可靠的检测方案，并成功应用于三种常用聚合物纳米纤维(PCL、PLA、PA)上的酵母生物膜研究。

研究采用四大关键技术：1) 静电纺丝制备标准化纳米纤维材料；2) 72小时静态培养建立单菌种生物膜模型；3) 菌落形成单位(CFU)计数作为金标准验证；4) 改良MTT法结合甲萘醌增强信号，通过分光光度法(595 nm)定量代谢活性。实验设计包含严格对照，所有材料均经环氧乙烷灭菌处理。

生物膜形成能力评估
通过CFU计数发现，两种酵母在所有测试材料上的生物膜密度均显著高于聚苯乙烯(PS)对照(p<0.05)。其中C. albicans在PA上的定植能力明显弱于PCL和PLA(p<0.01)，而S. cerevisiae在不同材料间差异较小。

MTT条件优化

基础MTT检测显示，4小时孵育后即无法区分不同浓度的浮游酵母。添加葡萄糖虽能增强C. albicans的信号区分度，但对S. cerevisiae反而造成低浓度样本假阳性。引入甲萘醌后，两种酵母的信号强度均显著提升，2小时即可获得理想结果。

生物膜代谢活性检测

最终方案(2小时甲萘醌-MTT)显示，C. albicans在PS上的代谢活性与PCL/PLA相当，而PA显著较低(p<0.01)。S. cerevisiae在所有NMs上的代谢活性均低于PS，与CFU计数结果呈现差异，提示可能存在VBNC(可存活但不可培养)状态细胞。

这项研究建立了首个针对纳米纤维材料上酵母生物膜的标准化代谢活性检测方案，其创新性体现在：1) 确定甲萘醌对穿透酵母细胞壁的关键作用；2) 验证短时(2小时)检测的可靠性；3) 揭示材料特性对酵母代谢状态的潜在影响。该方案弥补了传统CFU计数法对VBNC细胞的检测盲区，为评估抗真菌材料性能提供了新维度。研究者特别强调，由于不同聚合物可能影响染料扩散，必须设置材料特异性对照。这些发现不仅推动了对酵母-材料相互作用的基础认知，更为医疗器械和食品包装的安全评估提供了重要方法学支持。