新型鲍曼不动杆菌噬菌体PD6A3穿孔素Hol6A3的表达特性与广谱抗菌应用研究

本研究针对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）多重耐药难题，首次成功表达并纯化了噬菌体PD6A3编码的穿孔素Hol6A3。研究团队通过原核表达系统获得1.47 mg/mL高纯度蛋白，证实其具有广谱抗菌活性（对ESKAPE病原体裂解率达18-50%）、优异的热稳定性（22-42℃）和pH耐受性（5.5-8.5），与内溶素Ply6A3联用可显著增强杀菌效果（协同抗菌活性达98.3%）。该成果为开发新型抗菌替代药物提供了重要理论依据。

　　

抗生素耐药性危机正成为全球公共卫生的重大挑战，其中鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）因其对碳青霉烯类抗生素的高耐药率（>96%）被世界卫生组织列为"紧急威胁级"病原体。面对传统抗生素失效的困境，噬菌体疗法重新进入科学家视野。然而噬菌体的高度宿主特异性限制了临床应用，这促使研究人员将目光转向噬菌体裂解系统的核心元件——穿孔素（Holin）与内溶素（Endolysin）。

复旦大学附属中山医院检验科与复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部重点实验室的联合团队，针对其先前分离的广宿主谱噬菌体PD6A3展开深入研究。研究人员通过全基因组测序锁定336 bp的hol6A3基因，利用生物信息学预测发现其编码的11.96 kDa蛋白具有典型I类穿孔素特征——含3个跨膜结构域（TMD），N端朝向周质空间而C端位于胞质。

为攻克穿孔素表达毒性难题，研究团队创新性地采用低温（16℃）诱导结合短时（4小时）表达策略，在BL21(DE3)pLysS宿主中实现高效表达。镍柱纯化获得1.47 mg/mL高纯度蛋白，Western blot在13 kDa处呈现清晰条带。功能实验显示Hol6A3具备显著优势：温度适应性测试中，22-42℃处理30分钟后仍保持>80%活性；pH稳定性实验中，在酸碱环境（pH5.5-8.5）下均表现稳定。

抗菌谱分析揭示Hol6A3突破噬菌体PD6A3的宿主限制：对200株临床分离的耐多药鲍曼不动杆菌（MDR-A. baumannii）裂解率达41.5%，更意外的是对金黄色葡萄球菌（50%）、肠杆菌属（22%）等ESKAPE病原体也显示裂解能力。与内溶素Ply6A3联用产生显著协同效应，使鲍曼不动杆菌裂解率提升至94.5%。连续传代实验证实细菌难以对Hol6A3产生耐药性，而对照组的噬菌体PD6A3在第5代即完全失效。

关键技术方法包括：1）基于GeneMarkS和BLAST的噬菌体基因组注释；2）pET28a(+)载体构建与低温诱导表达；3）镍柱亲和层析纯化；4）450株ESKAPE病原体临床分离株（获自复旦大学附属中山医院）的裂解谱检测；5）CCK-8法评估细胞毒性。

主要研究发现：

1. 蛋白特性：SDS-PAGE与Western blot验证Hol6A3成功表达，纯化浓度达1.47 mg/mL
2. 稳定性：在22-42℃和pH5.5-8.5范围内保持稳定活性
3. 抗菌机制：通过形成跨膜通道破坏细菌膜结构，单独使用对AB115菌株抗菌活性达80.1±1.4%
4. 协同效应：与Ply6A3联用使抗菌活性提升至98.3±0.93%
5. 安全性：1 mg/mL浓度处理24小时后，HEK293T细胞存活率降至30%

这项研究首次实现了鲍曼不动杆菌噬菌体穿孔素的高效表达，其广谱抗菌特性与低耐药诱导率为应对"后抗生素时代"挑战提供了新思路。虽然细胞毒性问题仍需解决，但Hol6A3作为环境消毒剂或与内溶素联用的抗菌增强剂具有明确应用前景。该成果为开发基于噬菌体裂解系统的下一代抗菌药物奠定了重要基础。