三元分裂pFAST荧光报告系统的设计与评估：活细胞中三元蛋白复合物的可视化新工具

研究人员针对活细胞中多蛋白复合物可视化难题，开发了基于pFAST荧光报告系统的三元分裂技术（tripartite-split-pFAST）。通过优化分裂位点（98-99/114-115）和荧光素（HMBR/HBR-2,5DM）结合特性，实现了动态三元蛋白互作的高时空分辨率成像，为研究膜接触位点（MCSs）和转录因子组装等过程提供了新工具。成果发表于《Nature Communications》。

　　

在细胞生命活动中，蛋白质往往以复杂的三元甚至多元复合体形式发挥作用，但现有技术如FRET（荧光共振能量转移）和BiFC（双分子荧光互补）仅能监测二元互作。这种局限性严重阻碍了对细胞信号传导、膜接触位点调控等关键过程的理解。如何突破技术瓶颈，实现活细胞内三元蛋白复合物的动态可视化，成为领域内亟待解决的难题。

法国索邦大学（Sorbonne University）Arnaud Gautier团队创新性地将化学遗传荧光报告系统pFAST（fluorescence-activating and absorption-shifting tag）进行三元分裂设计。通过计算预测和实验验证，确定了98-99和114-115两个关键分裂位点，构建出三个互补片段（pFAST_1-98、pFAST_99-114和pFAST_115-125）。当这些片段通过靶蛋白的互作被拉近时，可快速可逆地结合荧光素HBR-2,5DM形成荧光四元复合体，其结合解离常数（K_D）达1.2±0.1μM，动态范围提升100倍。该成果发表于《Nature Communications》，为研究高阶蛋白组装提供了突破性工具。

研究采用四大关键技术：1）基于CPred算法的分裂位点预测；2）正交蛋白工程改造RspAFAST片段降低背景信号；3）流式细胞术定量互补效率（EC₅₀参数分析）；4）共聚焦显微镜实时追踪膜接触位点的荧光信号动态。

功能位点筛选与验证
通过比较七种环状排列变体（cpFAST），发现98-99位点分裂的RspAFAST片段与FRB/FKBP系统联用时，在雷帕霉素诱导下EC_{50,+interaction}降至3.0±0.3μM，而自发互补背景（EC_{50,-interaction}）高达270μM。

三元系统构建
将pFAST分裂为三个片段后，采用HBR-2,5DM荧光素时互补效率显著提升。在FRB-FKBP化学诱导三聚化（CIT）模型中，荧光信号10分钟内增强10倍，半衰期<2分钟。

膜接触位点成像
在HeLa细胞中成功监测到线粒体-内质网-质膜三器官接触位点的形成：

图像相关系数分析显示，雷帕霉素处理后信号共定位显著增强（P<0.0001）。

Fos-Jun-DNA复合体检测
通过将片段分别融合bZIP结构域和组蛋白H2B，在细胞核内特异性检测到AP-1转录因子与DNA的相互作用，而缺失突变体bFosΔ(179-193)则完全丧失信号。

该研究开创性地将化学遗传报告系统拓展至三元互作检测领域，其快速可逆的特性克服了传统BiFC技术的时间分辨率限制。通过精确控制片段互补的能量阈值，实现了背景信号的最小化（<6.5%）和诱导信号的最大化（81%）。特别在膜接触位点研究中，技术首次证实了三器官连接结构的存在，为细胞器互作网络研究提供了全新视角。Sara Bottone等开发的技术平台，未来可广泛应用于转录调控、信号转导和细胞器动态等领域的高阶蛋白复合体研究。