Cas13d介导的异构体特异性RNA敲降：整合计算与实验工具揭示RNA剪接调控新机制

本研究针对RNA异构体功能研究的实验方法匮乏和计算工具不足两大挑战，开发了基于CRISPR/Cas13d系统的外显子-外显子连接区(EEJ)靶向策略，结合深度学习模型TIGER和Isoviz软件包，实现了跨细胞类型、跨事件类型的RNA异构体特异性敲降。研究通过大规模Cas13d必需性筛选证实EEJ靶向的普适性，利用PacBio长读长测序验证RBFOX2异构体特异性敲降效果，并发现低丰度N-long异构体在hESCs中主导蛋白质表达和剪接调控功能。该研究为解析RNA剪接(AS)、可变转录起始(AltTSS)等事件的功能后果提供了通用解决方案。

　　

在生命科学领域，人类基因通过可变剪接(AS)、可变启动子(AltTSS)等机制产生大量RNA和蛋白质异构体，这种多样性对发育、组织分化和疾病进程至关重要。然而，现有技术难以实现内源性异构体的特异性调控：DNA编辑CRISPR系统难以精确区分高度相似的异构体，RNAi和反义寡核苷酸主要靶向单个外显子，而长读长测序技术的进步更使得GENCODE数据库五年内新增5.5万条转录本注释，凸显了实验方法与注释增长间的巨大鸿沟。

纽约基因组中心(New York Genome Center)的Megan D. Schertzer团队在《Nature Communications》发表的研究，创新性地将RNA靶向CRISPR/Cas13d系统与跨外显子连接区(EEJ)的向导RNA(gRNA)设计相结合，构建了覆盖转录起始、剪接位点选择等全类型可变事件的普适性调控平台。研究通过深度学习模型TIGER预测gRNA效率，开发Isoviz软件实现异构体可视化设计，并发现EEJ靶向遵循与常规外显子相同的序列规则，打破了"剪接复合体可能阻碍Cas13d结合"的理论假设。

研究采用三大关键技术：1) 在A375细胞中开展5万gRNA的大规模Cas13d必需性筛选，通过SEABASS线性混合模型整合多时间点数据；2) 建立非病毒piggyBac转座子系统实现HEK293和hESC细胞的诱导型Cas13d表达；3) 结合PacBio长读长测序(LRS)和靶向质谱，定量RBFOX2不同N端异构体的RNA/蛋白表达差异。

Cas13d必需性筛选揭示EEJ广泛可靶向性
通过系统分类GENCODE v41中53,890个蛋白编码EEJ，发现97%的多异构体基因含有独特或部分独特的EEJ靶点。针对942个必需基因的6,932个EEJ进行tiling设计，证实30.3%的gRNA能有效敲降Gold Standard必需基因，其中72%的EEJ至少有一个有效gRNA。值得注意的是，CCT8等基因所有EEJ均可靶向，而EXOSC10等基因靶向性不足50%，这种差异与RNAi筛选的基因必需性评分高度相关。

深度学习破解EEJ靶向规则
比较TIGER模型四种变体发现，基于SEABASS斜率训练的TIGER_bass表现最优(Pearson R=0.63)。SHAP分析表明，EEJ与常规外显子的gRNA效率决定因素完全一致，且上下游50bp序列背景不影响预测效果。研究进一步提供220万EEJ gRNA的TIGER预测结果，其中89%多异构体基因可通过EEJ实现特异性靶向。

Isoviz工具实现异构体精准调控
该R包整合GENCODE注释与实验数据，可视化展示COP1等基因的EEJ-异构体对应关系。实验验证显示，针对SPAG9基因117144 EEJ的gRNA使HEK293中对应异构体表达降低83%，而其他异构体不受影响。在MKNK2可变末端外显子模型中，128208 EEJ gRNA实现87%的特异性敲降。

RBFOX2异构体功能异质性发现
PacBio LRS在hESC中鉴定出12种RBFOX2异构体（6种未注释），其中含178147 EEJ的N-short异构体占RNA总量的76%，而含178149 EEJ的N-long仅占24%。令人惊讶的是，N-long敲降导致总蛋白水平下降83%（质谱验证），并影响35个外显子跳跃事件(SE)，而N-short敲降仅使蛋白降低27%且无显著剪接改变。这表明低丰度RNA异构体可能通过翻译效率或蛋白稳定性主导生物学功能。

这项研究建立了首个全面覆盖可变剪接、可变转录起始等事件的异构体调控体系，其创新性体现在三方面：1) 证实EEJ靶向不受剪接复合体阻碍，拓展了CRISPR/Cas13d的应用场景；2) 发现N端序列变异通过翻译调控影响蛋白功能的普适机制；3) 开源TIGER预测模型和Isoviz设计工具将推动领域标准化研究。该成果对理解癌症中30%增加的AS事件、神经精神疾病的剪接数量性状位点(sQTL)等具有重要价值，为发展基于RNA异构体的精准治疗提供了新思路。