综述：研究微生物铁稳态和氧化应激的工具：当前技术及方法学上的空白

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Tools to study microbial iron homeostasis and oxidative stress: current techniques and methodological gaps

微生物铁代谢调控及其检测方法研究

　　铁是生命活动中不可或缺的营养元素，对微生物病原体及其宿主的生长、生存和代谢功能具有重要意义。它在多种生物过程中扮演着关键角色，包括酶促反应、DNA合成与修复、电子传递链、氧化磷酸化以及氮固定和呼吸等。铁的氧化还原特性使其在自然界中广泛存在于不同的化学形式中，例如二价铁（Fe2?）和三价铁（Fe3?）。在不同pH值和氧化还原条件下，铁的可溶性和生物利用性存在显著差异。在高pH值和有氧环境中，Fe3?是主要形式，但其溶解性较低，限制了其在好氧微生物中的生物利用性；而在厌氧或微需氧条件下，Fe2?的可溶性较高，但其化学性质不稳定，容易在采样和检测过程中发生氧化，给分析带来挑战。

微生物病原体为了在铁受限环境中生存，进化出复杂的铁获取机制，包括合成铁载体、利用血红素和宿主铁结合蛋白，以及通过特异性受体进行铁的运输。这些铁获取机制与病原体的致病性密切相关，如黏附能力、运动性、毒素分泌和生物膜形成等。在ESKAPEE病原体（包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌属和大肠杆菌）中，铁的限制会促进生物膜的形成，这不仅增强了病原体对抗生素和免疫系统的抵抗能力，还促进了慢性感染的发生。此外，病原体还可以通过操控宿主的铁代谢，加剧炎症反应和疾病进展。因此，铁在感染动态中扮演着双重角色，既是微生物生长的必要营养素，也可能在过量情况下导致氧化应激，进而引发细胞损伤和铁死亡（ferroptosis）。

铁的过量积累会对细胞造成严重的氧化应激，从而引发一系列有害的生物化学反应，例如芬顿反应和哈伯-韦斯反应，这些反应会生成高反应性的羟基自由基（·OH）和更多的Fe3?，进一步加剧氧化损伤。这种铁依赖的细胞死亡机制最初在哺乳动物细胞中被发现，并被探索为癌症治疗策略之一，但近年来在微生物中也得到了观察。铁的代谢调控机制和解毒系统在维持细胞内铁的可用性与防止铁诱导的损伤之间起着关键作用，因此成为对抗耐药性危机的重要研究方向。理解铁在微生物代谢中的作用，不仅有助于揭示其在宿主-微生物相互作用中的生物学意义，还可能为感染疾病的治疗策略提供新的思路。

除了其在宿主-病原体相互作用中的重要性，微生物铁代谢还对环境过程产生深远影响。许多细菌参与铁的氧化和还原，推动了地球化学循环中的关键转变。这些微生物介导的氧化还原反应影响全球现象，如海洋生产力、碳固定和污染物的命运。微生物活动改变的铁物种化，进一步影响了多种元素的溶解性、迁移性和生物可利用性，包括营养元素和有毒金属。近年来，研究人员发现了许多新的微生物途径，例如与Fe3?还原耦合的铵和甲烷氧化过程。此外，铁的氧化还原反应往往在空间上重叠，并可能在相同生态位中同时或循环发生。这些发现突显了微生物铁代谢不仅在宿主相关环境中起作用，还在土壤、沉积物和水体等更广泛的生态系统中具有重要地位。因此，为了准确理解和分析这些复杂的相互作用，需要开发适用于不同环境的铁定量工具，以捕捉动态的铁物种化和氧化还原循环。

为了检测和定量微生物系统中的铁，目前有多种方法可供选择，每种方法都有其特定的优势和局限性。例如，比色法因其简便性和成本效益，成为快速检测铁含量的常用手段。比色法依赖于铁与特定试剂（如Ferrozine、1,10-邻二氮菲和浴苯二氮菲）形成特定颜色的络合物，并通过分光光度计测量其在特定波长下的吸光度。然而，这种方法对于Fe3?的直接检测较为困难，通常需要通过酸化或还原处理来间接测定。相比之下，原子吸收光谱法（AAS）能够提供更精确的总铁定量，但其分析过程涉及复杂的样品消化步骤，可能影响铁的物种特异性。电化学方法，如伏安法和安培法，能够实现高灵敏度和实时监测，适用于超痕量铁的检测，但对电极的处理和校准要求较高。荧光和化学发光方法则为铁的检测提供了新的选择，能够实现对细胞内铁的高分辨率监测，但可能受到样品自身荧光的干扰。

在微生物铁获取的研究中，铁载体检测法（如Chrome Azurol S, CAS）是一种重要的工具。该方法通过颜色变化来判断微生物是否能够结合铁，成为评估铁载体生产能力的金标准。然而，CAS检测法仅能提供关于铁载体介导铁获取的间接信息，无法直接测量总铁含量。因此，研究人员开发了多种改进方法，以提高其灵敏度、特异性和微生物兼容性。例如，缓冲液无CAS（bf-CAS）系统结合稀释的R2A培养基，使难以在铁限制条件下生长的微生物也能被检测。此外，结合其他技术，如微孔板和双层琼脂法，可以提高筛选效率并减少试剂使用。

分子生物学方法，如报告基因实验和转录组学分析，为研究铁调控提供了更深层次的视角。报告基因实验通过将铁调控的启动子与报告基因（如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、细菌荧光素酶等）连接，实现对铁响应的实时监测。而转录组学技术，如定量PCR和RNA测序，则能够全面分析铁调控基因的表达模式，揭示铁对微生物代谢和致病性的调控机制。这些方法虽然不直接测量铁的浓度，但提供了关于铁在微生物生命活动中的作用机制的重要信息。

综上所述，铁在微生物和宿主之间的相互作用中具有核心地位，其可溶性和氧化还原状态对病原体的致病性、抗生素耐药性和环境适应性产生深远影响。当前的铁检测和定量方法各有优劣，需要根据具体的研究目标、样品类型和实验条件进行选择。未来的研究方向将更加注重开发高通量、自动化和实时监测的检测平台，以适应微生物研究的复杂需求。同时，结合多组学分析和人工智能技术，将进一步推动对铁代谢机制的深入理解，为抗菌治疗和环境监测提供新的工具和策略。随着对铁在微生物代谢中的多重作用的认识不断加深，其在感染疾病管理、环境调控和生物技术中的应用前景也将更加广阔。