大豆分离蛋白对阿拉斯加鳕鱼肉挤压诱导结构化协同效应的分子机制：蛋白质构象转变与纤维结构形成

本研究针对积雪草苷(C28-O-糖基化)生物合成效率低下的瓶颈问题，通过计算机辅助半理性设计对糖基转移酶CaUGT73AD1进行结构导向改造。研究人员基于蛋白表面电荷工程获得的H70E/N481E突变体，开发出组合变体H70E/N481E/N149V/E396D，使积雪草酸单葡萄糖苷转化率提升43.0%，多酶级联合成的积雪草苷积累量提高61.1%。分子动力学模拟揭示其活性提升源于糖基化反应中供体-受体距离缩短，为三萜皂苷的定向生物合成提供了新策略。

　　

在传统药用植物积雪草中，积雪草苷作为重要的五环三萜皂苷，因其显著的伤口愈合、神经保护和抗氧化活性被广泛应用于医药和化妆品领域。然而，植物提取法难以满足市场需求，而微生物异源合成又面临关键限速步骤——积雪草酸C₂₈位O-糖基化效率低下的挑战。尽管前期通过蛋白表面电荷工程使CaUGT73AD1糖基转移酶的转化率达到67.6%，但这一效率仍制约着工业化生产。

江南大学（国内研究机构）的研究团队采用结构导向的蛋白质工程策略，基于AlphaFold预测的酶三维结构，对已获得的H70E/N481E突变体进行计算机辅助半理性设计。通过分子对接识别活性口袋关键位点，构建了包含N149V/E396D的新组合变体。该研究运用分子动力学模拟解析构效关系，并建立多酶级联催化体系验证改造效果。

关键技术包括：1）基于AI结构预测的计算机辅助半理性设计；2）定点饱和突变文库构建；3）UPLC-MS定量分析糖基化产物；4）500 ns分子动力学模拟分析酶-底物相互作用；5）多酶级联反应优化。

【关键研究结果】

1. 分子对接识别活性口袋关键位点：通过对接分析发现N149和E396位点影响底物结合腔的疏水环境和氢键网络，其中N149V突变可消除空间位阻，E396D则优化了催化微环境。

2. 组合变体的催化性能提升：最优变体H70E/N481E/N149V/E396D使积雪草酸单葡萄糖苷转化率从59.3%提升至84.8%，催化效率(k_cat/K_m)提高2.3倍。

3. 多酶级联合成验证：在三酶（CaUGT73AD1变体/CaUGT73C7/UGT94M2）体系中，积雪草苷产量达到1.87 g/L，较原始体系提高61.1%。

4. 分子机制解析：MD模拟显示突变体使UDP-葡萄糖供体与积雪草酸受体的平均距离缩短1.8 ?，且关键残基R372与底物的氢键相互作用持续时间延长37%。

该研究通过"结构-功能"双驱动策略，实现了糖基转移酶CaUGT73AD1的精准改造。组合变体不仅显著提升了单步糖基化效率，其与后续糖基转移酶的协同性优化更为三萜皂苷的微生物全合成提供了关键酶元件。研究揭示的"缩短供体-受体距离"这一活性提升机制，为其他植物天然产物的糖基化工程提供了普适性指导。论文发表于《Food Hydrocolloids》，相关技术已申请国家发明专利（2024YFF1106400），对推动高值植物天然产物的绿色制造具有重要意义。