基于计算机辅助半理性设计的糖基转移酶CaUGT73AD1变体提升积雪草酸C28-O-糖苷化效率研究

本研究针对积雪草苷生物合成中C28-O-糖基化效率低下的瓶颈问题，通过计算机辅助半理性设计对糖基转移酶CaUGT73AD1进行结构导向改造。研究人员开发的组合变体CaUGT73AD1H70E/N481E/N149V/E396D使积雪草酸单葡萄糖苷转化率提升43.0%，多酶级联催化使积雪草苷积累量提高61.1%。该成果为糖基化修饰工程提供了新范式，对天然产物工业化生产具有重要价值。

　　

在天然产物研究领域，三萜皂苷类化合物因其卓越的生物活性备受关注。其中，积雪草苷作为药用植物雷公根的主要活性成分，具有促进伤口愈合、神经保护等多种药理作用，在化妆品和医药领域应用广泛。然而，传统植物提取法难以满足市场需求，而通过微生物细胞工厂进行异源合成又面临关键瓶颈——积雪草酸C₂₈位点的糖基化修饰效率低下。尽管前期研究发现糖基转移酶CaUGT73AD1能催化该反应，但67.6%的转化率仍制约着工业化生产进程。

针对这一挑战，国内某研究机构的研究人员开展了一项创新性研究。他们基于前期通过蛋白质表面电荷工程获得的CaUGT73AD1^H70E/N481E变体，采用计算机辅助半理性设计策略，成功开发出催化效率显著提升的新型变体，相关成果发表在《Food Hydrocolloids》期刊。

研究主要运用了以下关键技术：1）基于AlphaFold预测结构的分子对接技术筛选关键位点；2）定点饱和突变构建突变体文库；3）高效液相色谱（HPLC）定量分析酶活；4）分子动力学（MD）模拟阐释催化机制；5）多酶级联反应系统验证合成效率。

【关键位点识别】
通过分子对接分析发现，N149和E396位点位于酶活性口袋入口，影响底物通道构象。研究人员对这两个位点进行饱和突变筛选，获得N149V和E396D两个正向突变。

【组合变体构建】
将筛选获得的突变位点与前期H70E/N481E变体组合，构建出四突变体CaUGT73AD1^{H70E/N481E/N149V/E396D}。该变体使积雪草酸单葡萄糖苷转化率提升至84.8%，较原始变体提高43.0%。

【级联催化验证】
在多酶反应体系中，新变体使积雪草苷最终产量提高61.1%，证实其对完整合成路径的增效作用。

【机制解析】
分子动力学模拟显示，突变缩短了糖供体（UDP-葡萄糖）与受体（积雪草酸）的距离，优化了催化中心的微环境，这是活性提升的结构基础。

这项研究通过结构导向的蛋白质工程策略，成功突破了积雪草苷生物合成中的关键限速步骤。其创新性体现在：首次阐明CaUGT73AD1活性口袋的动态构象特征；开发出目前效率最高的C₂₈-O-糖基化变体；为其他三萜皂苷的定向合成提供了可借鉴的改造范式。该成果不仅推动了天然产物的绿色制造进程，也为糖基转移酶的理性设计建立了新方法。特别值得注意的是，研究中建立的"计算机预测-实验验证-机制解析"技术路线，可广泛应用于其他重要天然产物的合成生物学研究。