首例高选择性1,4-二氢吡啶并[3,4-b]吡嗪-3(2H)-酮类MKK4抑制剂的发现及其在肝再生治疗中的突破性应用

研究人员针对肝衰竭治疗选择有限的重大医学挑战，通过靶向丝裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）开发新型小分子抑制剂。基于非选择性RSK抑制剂BI-D1870的结构优化，成功设计出高选择性1,4-二氢吡啶并[3,4-b]吡嗪-3(2H)-酮类化合物39和45，其MKK4抑制活性达纳摩尔级（IC50分别为78 nM和22 nM），且显著降低对RSK4等脱靶激酶的活性。该研究为肝再生治疗提供了全新药物设计策略，相关成果发表于《Journal of Medical Mycology》。

　　

肝脏疾病是全球健康重大威胁，每年导致超200万人死亡，其中非酒精性脂肪肝病（NAFLD）因缺乏有效疗法而发病率持续攀升。2013年，科学家通过全基因组RNAi筛选发现丝裂原活化蛋白激酶激酶4（Mitogen-activated protein kinase kinase 4, MKK4）是肝细胞再生的关键调控因子——其基因沉默可减少纤维化、加速细胞周期进程并增强抗凋亡能力，这使其成为治疗退行性肝病的理想靶点。然而现有MKK4抑制剂普遍存在选择性差、毒性大等问题，开发高选择性抑制剂成为当务之急。

德国蒂宾根大学（Eberhard Karls University Tübingen）药物化学系的Leon Katzengruber团队通过"脱靶转靶向"策略，将非选择性激酶抑制剂BI-D1870改造为高选择性MKK4抑制剂。研究人员采用计算机辅助的同源建模确定结合模式，通过系统性结构修饰（包括二氢蝶啶酮核心改造、N-8烷基链优化及酚羟基pK_a调控），最终获得化合物39和45。这两种化合物不仅对MKK4表现出纳摩尔级抑制活性（IC₅₀分别为78 nM和22 nM），且对RSK4的选择性分别提高37倍和48倍。激酶谱分析显示化合物39在1 μM浓度下仅抑制3种激酶，显著优于母体化合物BI-D1870（抑制20种激酶）。细胞实验证实其毒性显著降低（TD₅₀>30 μM），并通过细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）验证了靶标结合特异性。

研究主要采用五大关键技术：1）基于³³P的放射测定法（PanQinase assay）评估激酶抑制活性；2）350种野生型激酶的谱系筛选；3）小鼠肝微粒体代谢稳定性测试；4）热迁移实验（Thermal Shift Assay）验证靶标结合；5）Nras^G12V;Cdkn2a^ARF-/-肝癌细胞系的细胞毒性评估。

结果与讨论
初始SAR：二氟酚基团的改造
通过系统修饰BI-D1870的二氟酚基团，发现酚羟基的酸性（pK_a≈7）对MKK4结合至关重要。四氟类似物16活性最佳（IC₅₀=73 nM），而移除氟原子（14）或酚羟基（13）导致活性丧失，提示其结合模式与RSK2相似。

铰链结合基序的鉴定
通过对比化合物18（IC₅₀=390 nM）和19（IC₅₀>100 μM）的活性，证实吡啶N-3是关键的铰链结合位点，这一发现为后续设计提供方向。

核心结构优化
去除C-7甲基（20）使活性提高7倍（IC₅₀=53 nM），而N-5乙基化（21）则显著降低活性，表明MKK4结合腔对该区域体积敏感。将酰胺羰基还原为亚甲基（22）导致活性丧失，提示其与Lys187可能存在氢键相互作用。

N-8脂链改造
环己基类似物23（IC₅₀=45 nM）表现出最佳活性，而环丙基衍生物28（IC₅₀=99 nM）具有更高选择性（RSK4/MKK4=4）。研究还发现体积增大虽提高RSK4活性但降低MKK4抑制，这种反向相关性为选择性设计提供依据。

酚基团pK_a与体积调控
引入氰基（39）和氯原子（45）分别获得37倍和48倍的选择性提升。特别值得注意的是，3-氟-2-羟基苯甲腈衍生物39对NLK和PLK2的脱靶抑制较弱（IC₅₀>977 nM），远优于母体化合物。

结论与意义
该研究首次报道了1,4-二氢吡啶并[3,4-b]吡嗪-3(2H)-酮类高选择性MKK4抑制剂，通过多参数优化解决了激酶抑制剂选择性差的共性难题。化合物39和45不仅具有优异的体外特性（代谢稳定性>120分钟），其独特的选择性特征（激酶谱评分0.009）更为肝再生治疗提供了安全候选药物。相较于已进入临床试验的HRX-215（Darizmetinib），该化学型展现出互补优势：通过非共价结合避免潜在毒性，且结构更易于进一步优化。这项工作不仅验证了MKK4作为肝病治疗靶点的可行性，也为开发其他MAPK通路抑制剂提供了范式。