铜绿假单胞菌毒力因子AaaA的结构与功能解析：一种具有精氨酸特异性氨基肽酶活性的自转运蛋白

本研究针对耐药性铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)感染治疗的迫切需求，首次成功纯化并解析了其关键毒力因子AaaA的3.87 ?冷冻电镜结构。该研究揭示了这一兼具自转运蛋白(Type V secretion system)和M28家族锌依赖性氨基肽酶双重特性的膜蛋白的精细三维构象，阐明了其精氨酸特异性催化机制，为开发靶向抑制剂提供了重要结构基础。

　　

在微生物与人类漫长的博弈史中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)始终扮演着"顽固分子"的角色。这种革兰氏阴性菌不仅是医院获得性肺炎的主要元凶，更是慢性阻塞性肺病(COPD)和囊性纤维化(CF)患者挥之不去的梦魇。随着COVID-19大流行期间呼吸机使用量激增，由其引发的呼吸机相关性肺炎更让临床医生束手无策。更严峻的是，世界卫生组织2024年细菌优先病原体清单已将其列为最高风险等级，现有抗生素对其日益失效的现状亟待突破。

面对这一挑战，密歇根州立大学(Michigan State University)生物化学与分子生物学系的研究团队将目光聚焦于细菌的"分子武器库"——自转运蛋白(Autotransporter)。这类由细菌自身编码的"智能导弹系统"能自动完成从合成、转运到表面展示的全过程，其中AaaA(Arginine-specific autotransporter of P. aeruginosa)因其独特的精氨酸代谢能力尤为引人注目。先前研究显示，敲除AaaA基因会显著削弱细菌毒力，但其分子机制始终笼罩在迷雾中。

研究人员通过创新性的异源表达策略，在Escherichia coli中成功获得全长AaaA蛋白。采用冷冻电镜(cryo-EM)技术首次捕捉到这一70 kDa膜蛋白的高清三维图像，结合点突变分析和酶活检测，系统揭示了其"一蛋白双功能"的独特性质。相关成果发表于《Journal of Molecular Biology》，为抗感染药物研发提供了精准的分子靶标。

关键技术路线包括：1) 采用含YftM信号肽和Twin-Strep II标签的工程化构建体实现异源表达；2) 基于DDM去垢剂的膜蛋白提取与两步层析纯化；3) 3.87 ?冷冻电镜结构解析；4) 锌离子依赖性酶活检测及pH/温度稳定性分析；5) 关键活性位点残基的定点突变验证。

【表达与纯化AaaA】
研究团队设计巧妙表达系统，通过Strep-Tactin亲和层析和分子排阻色谱获得高纯度蛋白。SEC图谱显示单一峰形，证实成功获取单分散性良好的全长蛋白，为后续研究奠定基础。

【结构特征】
冷冻电镜结构清晰展示经典自转运蛋白三域架构：信号肽、乘客域(Passenger domain)和转位域(Translocator domain)。突破性发现其乘客域呈现罕见的球状折叠，与多数自转运蛋白的延伸构象形成鲜明对比。活性中心存在锌离子配位结构，带负电的底物结合口袋完美解释其对精氨酸的特异性识别。

【功能验证】
酶活实验证实AaaA在pH 6-10和20-60°C范围内保持稳定活性，符合病原体在宿主体内的生存环境。关键组氨酸(His⁴⁶⁶)和谷氨酸(Glu²⁹⁸)突变导致酶活完全丧失，验证了预测的催化机制。

这项研究首次在原子水平揭示AaaA的双重功能机制：其自转运特性确保表面定位，而精氨酸特异性切割能力既为细菌提供氮源，又通过消耗宿主精氨酸削弱一氧化氮(NO)依赖的免疫防御。特别值得注意的是，AaaA在临床分离株中的高度保守性，使其成为广谱抗P. aeruginosa药物的理想靶点。

Erandi Jayawardana Arachchige等研究者取得的突破不仅填补了自转运蛋白结构数据库的空白，更开辟了"结构指导的毒力因子抑制"新路径。相较于传统抗生素，靶向AaaA的策略有望实现"精准去武装"，在不杀死细菌的前提下解除其致病力，这种抗毒力(Anti-virulence)疗法可能带来更小的选择压力，延缓耐药性产生。随着全球对抗菌药物耐药危机重视程度不断提升，这类研究正为后抗生素时代提供新的解决方案。