重构衣壳-核芯平台揭示UL25和UL36在疱疹病毒衣壳锚定中的独特作用

推荐：研究人员利用PVX(potato virus X)为基础的瞬时表达系统(pEff)探究等轴病毒TCV(turnip crinkle virus)和STNV-1(satellite tobacco necrosis virus-1)的RNA包装特异性。研究发现病毒RNA复制是决定包装特异性的主要因素，而非此前认为的包装信号(PSs)，该成果为理解植物RNA病毒组装机制提供了新视角。

　　

在RNA病毒的生命周期中，基因组RNA如何被特异性包装进病毒颗粒是个关键科学问题。传统理论存在两大假说：一是特定RNA序列即"包装信号"(PSs)指导选择性包装，二是病毒复制与组装在"复制工厂"内耦合完成。然而这些假说在植物等轴病毒中缺乏直接证据，特别是PSs的功能存在争议。

英国约翰英纳斯中心(John Innes Centre, Norwich Research Park)的研究团队在《Journal of Molecular Biology》发表创新成果。他们巧妙构建了基于马铃薯X病毒(PVX)的pEff瞬时表达系统，该系统能同时表达芜菁皱缩病毒(TCV)和烟草坏死卫星病毒-1(STNV-1)的衣壳蛋白并产生复制型RNA。通过冷冻电镜(cryo-EM)、密度梯度离心和Northern blot等技术，团队发现：1）仅复制型RNA被特异性包装；2）改变预测的PSs序列不影响包装特异性但影响效率；3）衣壳蛋白的N端R结构域对RNA结合至关重要。

关键技术包括：1）构建含TCV/STNV-1衣壳蛋白基因的pEff载体；2）通过农杆菌浸润本氏烟叶片获得病毒样颗粒(VLPs)；3）采用铯硫酸梯度离心纯化颗粒；4）冷冻电镜解析颗粒结构达2.8-3.5?分辨率；5）Northern blot分析包装RNA的起源。

【Transient pEff-based expression of wild-type forms of the TCV and STNV coat proteins】
研究发现pEff系统表达的TCV-P38形成直径34-36nm的T=3颗粒，而缺失N端R结构域的TCV-P29形成20-23nm的T=1颗粒。RNA分析显示仅复制型亚基因组RNA(1.3kb)和截短的基因组RNA(3.8kb)被包装，宿主RNA未被检测到。

【Analysis of the role of putative TCV packaging signals】
突变TCV衣壳蛋白基因3'端预测的茎环结构(8个碱基改变)不影响RNA包装。而将C端71个氨基酸对应的213nt序列替换为疟原虫密码子偏好序列后，包装效率下降但特异性不变，添加野生型序列拷贝不能互补此缺陷。

【STNV encapsidation】
在STNV-1衣壳蛋白编码区沉默突变预测的PS2-PS5或单独突变PS3后，包装特异性保持不变，但PS3突变使RNA包装量减少40%，表明PSs可能影响包装效率而非特异性。

【Cryo-EM Analysis of VLPs】
冷冻电镜结构解析显示，TCV-P38+1颗粒(3.1?)与野生型TCV结构完全一致，STNV-1颗粒(2.8?)结构也与已知结构高度吻合，证实表达系统产生的VLPs结构真实可靠。

该研究颠覆了传统认知，证明在等轴植物RNA病毒中，复制过程而非特定序列是包装特异性的主要决定因素。这一发现为理解病毒组装机制提供了新范式，对开发抗病毒策略和病毒载体应用具有重要指导意义。研究还建立了高效的VLPs制备平台，其分辨率达2.8?的冷冻电镜结构为后续研究提供了精确模型。值得注意的是，衣壳蛋白N端R结构域对RNA结合的关键作用，以及密码子使用偏好对包装效率的影响，都为工程化改造病毒颗粒提供了新思路。