微生物组差异丰度分析中基于组间归一化的创新方法：G-RLE与FTSS框架的建立与应用

针对微生物测序数据中因组成性偏差导致的差异丰度分析(DAA)假阳性率高的问题，哈佛大学团队提出组间归一化新框架，开发G-RLE(组间相对对数表达)和FTSS(折叠截断总和标度)方法。通过模型与合成数据验证，该方法较传统样本级归一化显著提升统计功效，在30%差异丰度的高偏倚场景下仍保持5%的FDR阈值，为微生物组研究提供更稳健的分析工具。

　　

微生物组研究正以前所未有的分辨率揭示人体各部位微生物群落与健康的复杂关联。然而，当科学家们试图通过高通量测序数据比较不同组别间微生物绝对丰度时，一个根本性挑战浮出水面：测序数据本质上是组成性的（compositional），即每个样本的菌群计数受限于测序深度（library size），只能反映相对丰度而无法直接体现绝对数量。这种特性导致传统统计方法在差异丰度分析（Differential Abundance Analysis, DAA）中产生系统性偏差，尤其当组间微生物总量差异较大时，假阳性结果会急剧增加——这一现象被称为"组成性偏倚"（compositional bias）。

哈佛大学陈曾熙公共卫生学院（Harvard TH Chan School of Public Health）的生物统计团队在《BMC Bioinformatics》发表的研究中，创新性地将归一化（normalization）重新定义为组间（group-wise）而非样本间（sample-wise）的任务。他们通过严格的数学推导证明，组成性偏倚本质上体现为组间总绝对丰度对数的比值（Δ参数），据此开发出两种新型归一化方法：组间相对对数表达（G-RLE）通过计算组池化数据的中位数折叠变化来消除Δ；折叠截断总和标度（FTSS）则基于高斯核密度估计识别非差异丰度菌群作为参考集。研究采用多层级零膨胀模型生成模拟数据，并基于真实口腔（PHACS队列）和肠道（MLVS/MBS队列）微生物组数据集构建合成数据验证方法性能。

关键技术包括：（1）建立考虑零膨胀和菌群相关性的多变量正态-多项分布混合模型；（2）基于MLVS/MBS和PHACS队列的372-344个OTU（操作分类单元）合成数据生成；（3）通过高斯核密度估计确定FTSS的参考菌群截断区间（p^*=0.4）；（4）与edgeR、DESeq2、metagenomeSeq等主流DAA工具的整合测试。

模型模拟结果
在30%菌群存在差异丰度、高方差（σ²=2）的挑战性场景下，FTSS-metagenomeSeq组合展现出73%的真阳性率（TPR），较传统GMPR方法提高9个百分点，同时将假发现率（FDR）从31%降至3%。G-RLE同样表现优异，证实组间归一化框架在信号密集时的稳定性优势。

合成数据验证
基于MLVS/MBS肠道菌群数据的模拟显示，当20%菌群存在差异时，FTSS维持FDR在5%阈值内，而RLE等样本级方法FDR膨胀至15%。在PHACS口腔菌群数据中，metagenomeSeq配合组间归一化成功克服60%零值的技术噪声，保持FDR可控。

实际应用发现
分析2,201名参与者的膳食纤维摄入与肠道菌群关联时，FTSS鉴定出7个显著相关菌种，包括与结肠黏液代谢相关的Blautia luti（logFC=1.032）和炎症标志物Ruminococcus torques（logFC=-0.405），各方法估计值差异<10%，证实低偏倚场景下的一致性。

这项研究通过严格的数学建模和实证分析，确立了组间归一化在微生物组DAA中的方法论优势。其核心突破在于将Δ偏倚识别为组间参数而非样本特性，使FTSS能通过模态估计精准校正系统误差。对于存在大量差异信号（如30%菌群变化）或高度零膨胀（如口腔菌群）的数据，该方法较ANCOM-BC等非归一化方法提升20%检测效能，为营养干预研究（如纤维摄入效应）和疾病标志物挖掘（如HIV相关口腔菌群失调）提供更可靠的分析工具。研究者开源的R软件包（https://github.com/dclarkboucher/microbiome_groupwise_normalization）将促进这一框架在生态学、临床医学等领域的广泛应用。