AAV载体实现小胶质细胞特异性高效基因表达：突破脑疾病治疗的关键技术

本研究针对小胶质细胞基因递送效率低、特异性差的技术瓶颈，通过优化AAV载体中miRNA靶序列与WPRE的拓扑排列，开发出特异性>90%、转导效率>60%的AAV-ab-WPRE-ab系统。该载体不仅实现大脑皮层小胶质细胞的长期特异性标记，还能通过9P31衣壳静脉给药实现全脑靶向，为阿尔茨海默病等神经退行性疾病的基因治疗提供了全新工具。

　　

在神经科学领域，小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫哨兵，其异常激活与阿尔茨海默病、中风等多种脑疾病密切相关。然而，由于小胶质细胞具有强大的抗病毒防御机制，传统的病毒载体难以实现高效特异的基因递送。以往研究中，即便使用小胶质细胞特异性启动子（如mlba1）结合神经元miRNA靶序列（miR.T），在脑皮层仍会出现严重的神经元"脱靶"表达，严重制约了相关基础研究和治疗开发。

日本群马大学（Gunma University Graduate School of Medicine）的研究团队在《Cell Reports Methods》发表突破性成果。研究人员通过系统优化腺相关病毒（AAV）载体的调控架构，创新性地将miR-9.T和miR-129-2-3p.T靶序列置于WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件）两侧，构建出AAV-ab-WPRE-ab载体系统。该研究不仅解决了皮层小胶质细胞标记的特异性难题，还首次实现了通过静脉给药对全脑小胶质细胞的靶向调控，为神经免疫研究提供了革命性工具。

关键技术包括：1）通过立体定位注射在小鼠运动皮层测试不同miR.T排列的AAV载体；2）采用免疫荧光定量分析转导效率和特异性；3）利用jGCaMP8s钙成像技术记录小胶质细胞动态；4）筛选血脑屏障穿透型AAV-9P31衣壳实现静脉给药。

【结果】
"Placing miR.T sequences upstream of WPRE significantly enhances neuron detargeting"：将miR.T置于WPRE上游使小胶质细胞标记特异性从8%提升至70%，双面排列（ab-WPRE-ab）更达90%，同时转导效率提升6倍。

"High microglial specificity in striatum and cerebellum"：优化载体在纹状体和 cerebellum 的特异性分别达96.7%和91.9%，证实其广谱适用性。

"Sustained expression 2 months post-injection"：注射两个月后仍保持74.2%特异性，荧光强度稳定，证实其长效性。

"Application to physiological experiments"：成功记录ATP诱导的小胶质细胞Ca²⁺瞬变（ΔF/F_basal=1.26±0.15）和突触动态，证明功能研究可行性。

"Systemic delivery using 9P31 capsid"：静脉注射AAV-9P31.ab-WPRE-ab实现全脑转导，皮层特异性达74%（排除血管内皮细胞后）。

【结论】该研究突破性地解决了三大难题：1）通过miR.T-WPRE拓扑优化实现皮层小胶质细胞高效特异标记；2）首次实现静脉给药的全脑靶向；3）保持长达两个月的稳定表达。特别值得注意的是，当使用CAG启动子替代mlba1时，载体转而在少突胶质细胞中表达，证实启动子选择的关键作用。这些发现不仅为神经退行性疾病的基因治疗铺平道路，其载体设计策略更为其他难转导细胞类型的靶向研究提供了范式。