iPSC来源胰岛细胞治疗产品的生物分布评估标准化研究：以胰腺胰岛细胞为例

本研究针对iPSC(诱导多能干细胞)衍生细胞治疗产品(CTPs)的生物分布评估缺乏标准化方法的问题，开发了基于LINE1-ddPCR(液滴数字PCR)的定量检测技术，并通过免疫缺陷小鼠模型证实iPSC来源胰岛细胞(iPICs)在移植部位可长期存活且无迁移风险，为再生医学产品的安全性评估提供了重要方法学参考。

　　

在再生医学领域，诱导多能干细胞(iPSCs)因其强大的分化潜能被视为革命性的治疗工具，然而其临床应用始终面临一个关键障碍——残留的未分化iPSCs可能形成畸胎瘤的风险。特别是对于iPSC衍生的胰腺胰岛细胞(iPICs)这类治疗产品，如何准确评估其在体内的分布和存活情况，成为制约临床转化的瓶颈问题。目前生物分布研究缺乏统一标准，不同实验室采用qPCR(定量聚合酶链反应)、流式细胞术等不同方法，导致数据可比性差，严重影响监管审批效率。

日本武田制药公司(Takeda Pharmaceutical Company Limited)与Orizuru Therapeutics的研究团队在《Molecular Therapy Methods》发表重要研究成果。针对上述问题，研究人员开发了基于人类特异性LINE1序列的液滴数字PCR(LINE1-ddPCR)检测技术，并建立标准化的生物分布评估方案。通过长达52周的动物实验证实，皮下移植的iPICs能稳定定植于移植部位，未出现向其他器官迁移的现象，为这类产品的安全性提供了直接证据。

研究采用三大关键技术：1)优化LINE1-ddPCR方法，使用合成质粒作为外源对照(EC)基因；2)建立跨组织基质的单点校准曲线定量体系；3)在NOG(NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Sug/ShiJic)免疫缺陷小鼠模型中进行长期追踪。样本来源包括肝、肾、心等14种组织及血液样本，通过整体器官匀浆处理确保检测代表性。

【Assay optimization】
研究人员设计的双通道检测系统可同时识别人类LINE1序列(FAM荧光)和犬源MC1R序列(VIC荧光)，通过优化引物探针浓度和反应条件，实现阳性/阴性液滴的清晰区分。如图1所示，该方法有效避免了传统Alu-qPCR的非特异性扩增问题。

【Assay validation】
验证实验显示该方法在3-10,000细胞/样本的范围内保持优异性能：QC样本的相对误差(RE)和变异系数(CV)分别控制在±35%和35%以内；校准曲线斜率差异不超过1.24倍，证实可采用单一校准曲线进行跨组织定量。通过100倍样本稀释，实际检测范围可扩展至300,000倍。

【In vivo biodistribution study】
在52周观察期内，移植部位的细胞数量呈现动态变化：初期下降后，26周恢复至移植量(2.5×10⁶个细胞)并保持稳定。值得注意的是，所有检测时间点均未在肝、肾、脾等13种器官及血液中检出iPICs，证实细胞严格局限在移植部位。虽然部分动物出现脾肿大(推测为品系特异性淋巴瘤)，但与治疗无关。

【DISCUSSION】
该研究建立的LINE1-ddPCR方法通过三点创新解决了行业痛点：1)合成质粒替代动物源gDNA(基因组DNA)，符合动物伦理；2)EC基因校正实现跨组织定量；3)液滴数字化检测克服基质效应。长期追踪数据首次证实，iPICs在皮下移植后能存活一年以上且保持位置稳定，这对糖尿病治疗具有双重意义：既证明可通过手术移除异常移植物确保安全性，又暗示疗效可能持续超过一年。研究提出的标准化框架(表3)为其他iPSC衍生产品的评估提供了范本，包括建议采用"细胞数/器官"作为肿瘤风险评价指标、选择免疫缺陷动物、设置几何级数时间点等关键参数。

这项研究不仅为iPICs的临床转化扫清了安全性评估障碍，其方法学创新更具普适价值——建立的检测体系可推广至其他人类细胞治疗产品的非临床研究，特别是需要长期监测的再生医学产品。未来研究可进一步验证该方法在大型动物(如非人灵长类)中的应用，并探索其对基因修饰细胞等动态分布产品的适用性。