福尔马林固定石蜡包埋组织中泛真菌测序的挑战与预测价值：一项5年回顾性研究

针对侵袭性真菌感染诊断中形态学重叠和环境污染风险等问题，研究人员通过5年回顾性研究评估了泛真菌测序(PFS)在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中的性能。结果显示，当组织中存在真菌元素时PFS灵敏度达54%，但病理学家仅凭形态学诊断的误差率高达37%，其中53%可能导致次优治疗。该研究为临床精准诊断提供了重要依据。

　　

侵袭性真菌感染是全球公共卫生的重大威胁，每年导致约380万人死亡。在美国，仅2018年就记录66万例住院病例，耗费67亿美元医疗支出。然而现有诊断方法面临严峻挑战：真菌培养灵敏度低且耗时长，组织病理学存在形态学重叠难题，而抗原检测如1,3-β-D-葡聚糖和半乳甘露聚糖检测覆盖谱系有限。尤其当临床未怀疑真菌感染时，传统方法可能完全漏诊。

美国犹他大学病理学系（University of Utah Department of Pathology）和ARUP实验室的研究团队在《American Journal of Clinical Pathology》发表了一项开创性研究。通过对461例样本进行5年回顾性分析，系统评估了泛真菌测序(PFS)在FFPE组织中的诊断效能。研究采用跨学科方法整合病理学复查、GMS/PAS特殊染色定量评估，以及针对28S/ITS2/h18S区域的测序技术，并通过双重复提取和阴性对照严格控制环境污染。

主要技术方法包括：1) 对153例含真菌元素的FFPE组织进行病理学再评估；2) 使用GMS染色量化真菌负荷（分为阴性/稀少/中等/丰富四级）；3) 通过28S/ITS2/h18S区域扩增实现物种鉴定；4) 结合临床资料分析诊断差异的治疗影响。

研究结果
低PFS灵敏度与组织类型相关
在含真菌元素的FFPE组织中PFS阳性率仅54%，显著低于新鲜组织(27%)。值得注意的是，当病理报告未描述真菌元素时，PFS阳性率骤降至9%，且均为环境污染物如Lentinus species（图2）。

特殊染色与PFS相关性有限
GMS阳性标本中仅49%PFS阳性，而10%GMS阴性样本却检出真菌（图3A）。PAS染色表现类似，58%阳性样本与PFS一致（图3B）。

形态学诊断的高误差风险
病理学家提出的66例属/种级诊断中，37%与PFS结果不符（表3）。典型案例包括将Cunninghamella误诊为Aspergillus（案例3），以及Blastomyces与Cryptococcus的混淆（案例10）。若按形态学结果治疗，53%病例可能接受次优方案。

真菌负荷与检测率无相关性
内部复查显示，60%高负荷样本（>50元素/HPF）PFS阳性，但中等负荷组也有50%检出率（图4），表明DNA提取效率受多因素影响。

讨论与意义
该研究首次大规模验证了PFS在FFPE组织中的应用边界：1) 必须存在组织学证实的真菌元素，否则9%假阳性率将导致过度诊断；2) 病理学家应避免单一属种诊断，建议采用描述性术语如"透明分隔菌丝"并附鉴别诊断；3) 特殊染色结果需谨慎解读，如案例10中Blastomyces的黏蛋白染色假阳性。

临床实践中，当冷冻切片发现真菌元素时，可同步送检新鲜组织至微生物实验室。对于PFS与形态学矛盾的结果（如案例6的Curvularia），需结合流行病学史重新评估。研究还揭示了重要技术局限：福尔马林导致的DNA片段化使PFS灵敏度难以突破60%，这为未来开发抗降解试剂提供了方向。

这项研究为临床制定了一项黄金准则：PFS应作为组织病理学的补充而非替代。正如作者强调的"描述优先于诊断"原则，该成果已被欧洲癌症研究与治疗组织(EORTC)指南引用，为全球侵袭性真菌感染的精准诊疗树立了新标准。