整合单细胞多组学解析人角膜细胞状态及关键转录因子的调控网络

本研究针对人角膜细胞状态注释不一致的问题，通过整合4项scRNA-seq数据构建角膜细胞状态元图谱，开发机器学习工具cPredictor实现精准注释，并联合scATAC-seq鉴定驱动细胞状态的关键转录因子。研究创建了首个标准化角膜参考图谱，揭示了POU3F3等新型标志物和TWIST1等调控因子，为角膜发育、疾病和再生研究提供重要资源。

　　

作为眼睛的"透明窗口"，角膜独特的层状结构承担着屈光和保护双重使命。这个精密的光学组织由多层细胞构成：最内层的角膜内皮细胞维持液体平衡，中间的基质层提供机械强度，表面的复层上皮则形成物理屏障。特别引人注目的是角膜缘区域的干细胞，它们像忠诚的卫士般持续更新上皮细胞，同时阻止结膜细胞和血管的入侵。然而，这个精密系统的细胞组成和调控机制仍存在诸多谜团。

近年来，单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术为解析角膜细胞异质性打开了新窗口，但不同研究团队对细胞状态的命名和标志基因存在明显分歧。这种"方言差异"严重阻碍了研究结果的比较和应用。更关键的是，决定细胞身份的关键转录因子(TF)仍知之甚少，这就像知道建筑图纸却找不到设计师。

荷兰奈梅亨大学医学中心分子发育生物学系（Radboud Institute for Molecular Life Sciences, RIMLS）的研究团队在《PNAS Nexus》发表的重要研究，通过整合四项公开的scRNA-seq数据集，构建了首个标准化的人角膜细胞状态元图谱。研究不仅开发出机器学习工具cPredictor实现细胞状态的精准注释，还通过整合染色质可及性数据(scATAC-seq)揭示了驱动细胞命运的关键调控网络。这项研究为角膜生物学研究建立了通用参考框架，并为再生医学提供了重要理论基础。

研究人员采用多组学整合分析策略：收集4项人角膜scRNA-seq原始数据统一处理；利用scVI算法整合数据集并鉴定21种细胞状态；开发基于支持向量机(SVM)的cPredictor工具；整合scATAC-seq数据进行转录因子结合位点分析；应用scANANSE构建基因调控网络(GRN)；通过免疫荧光验证新标志物。研究使用了两例70-71岁男性捐赠的角膜组织进行验证实验。

数据收集和整合揭示角膜细胞状态全景图
通过整合65,036个细胞的转录组数据，研究构建了包含21种细胞状态的元图谱，分为角膜上皮（9群）和非上皮（12群）两大分支。创新性地鉴定出非髓鞘化角膜施万细胞(nm-cSC)等罕见群体，这些细胞在单个研究中因数量过少而被忽视。整合分析还解决了不同研究间命名混乱的问题，如将Catalá等描述的"limbal progenitor"和Collin等定义的"limbal stem cells"统一归为LSC-1和LSC-2两个亚群。

新型标志物拓展角膜认知边界
研究发现了多个新型细胞标志物：SLC6A6特异性表达于静息态角膜缘干细胞(LSC-1)，免疫荧光证实其与p63共定位于缘部；心肌标志物TNNC1意外成为角膜内皮特异性标记；POU3F3在基质keratocyte细胞核中的表达模式首次被报道。这些发现通过免疫组化在捐赠角膜组织中得到验证，为角膜细胞鉴定提供了新工具。

cPredictor工具突破注释瓶颈
开发的机器学习流程cPredictor通过递归特征消除将基因特征缩减至1243个，交叉验证显示加权F1值达95.75%。应用测试显示，该工具能准确识别原研究中未报道的稀有细胞类型，如仅占0.1%的nm-cSC。在iPSC来源角膜类器官的评估中，cPredictor揭示类器官细胞状态与成人角膜存在显著差异，4月龄类器官中仅结膜细胞和成纤维细胞状态较为成熟。

转录调控网络解码细胞命运开关
整合scATAC-seq的调控分析发现：上皮分支富集TP63、PAX6等已知TF，其中SMAD3在LSC-2特异性激活；基质细胞中TWIST1等bHLH家族因子起主导作用。GRN分析进一步鉴定出四类调控模式：AP-1复合物成员普遍活跃；FOXC1等在基质中更具影响力；CEBPD等同时调控上皮和基质；POU3F3等呈现细胞类型特异性。这些发现为理解角膜细胞分化提供了全新视角。

这项研究创建的角膜细胞状态元图谱和cPredictor工具，解决了长期存在的注释标准不统一问题。通过多组学整合，不仅系统描绘了角膜细胞组成全景图，更揭示了从静息干细胞到终末分化细胞的连续变化轨迹和调控枢纽。特别值得关注的是鉴定出的新型标志物如SLC6A6和TNNC1，它们可能参与角膜独特的生理功能。研究发现iPSC类器官与成人角膜的显著差异，为优化类器官培养体系提供了明确方向。这项研究建立的开放资源（https://huggingface.co/spaces/Zhou-group/corneal_cell_state_meta_atlas）将持续推动角膜发育、疾病和再生研究，为治疗角膜盲等重大疾病奠定分子基础。