逆向进化揭示氨基酸字母表扩展对蛋白质折叠与结形成的影响机制

研究人员通过建立逆向进化方法，以氨基酸字母表长度为进化时间代理，采用蒙特卡洛模拟和Cα模型，探究了FN3、MJ0366和YibK三种蛋白质的折叠与结形成过程。发现早期10氨基酸字母表虽能组装复杂结构，但显著影响深结蛋白YibK的折叠协同性，为解释蛋白质深结罕见性提供了新视角。

　　

在生命起源与蛋白质进化领域，一个长期悬而未决的问题是：为何现代生物仅选择20种标准氨基酸构建蛋白质？更引人深思的是，蛋白质结构数据库中深度打结（deep knots）的构象为何如此稀少？这些谜题背后可能隐藏着氨基酸字母表扩展与蛋白质折叠能力之间的深刻联系。

为解答这些问题，来自葡萄牙里斯本大学（Universidade de Lisboa）生物系统与综合科学研究所（BioISI）的Jo?o N.C. Especial和Patrícia F.N. Faísca团队创新性地开发了逆向进化研究方法。他们通过将氨基酸字母表长度作为进化时间标尺，系统研究了从现代20氨基酸回溯至假想祖先10氨基酸过程中，蛋白质折叠与结形成的动态演变规律。这项突破性成果发表在《Biophysical Journal》上，为理解氨基酸字母表扩展的生物学意义提供了定量依据。

研究采用三项关键技术：1）建立逆向进化框架，通过逐步缩减氨基酸字母表（从20种到10种）模拟进化回溯；2）构建基于天然结构的C_α（蛋白质α碳骨架）粗粒化模型；3）应用蒙特卡洛模拟分析三种典型蛋白质（非结蛋白FN3、浅结蛋白MJ0366和深结蛋白YibK）的热力学与动力学特性。

【热稳定性演变规律】通过自由能计算发现，所有测试蛋白质在现代20氨基酸字母表下均表现出最高热稳定性，且稳定性随字母表扩展呈单调递增趋势。特别值得注意的是，10氨基酸祖先字母表虽能维持FN3和MJ0366的基本折叠能力，但对YibK的稳定作用显著减弱，ΔG（吉布斯自由能变）值降低达40%。

【折叠协同性分析】二维自由能面计算揭示，现代字母表下FN3和MJ0366保持典型的两态折叠（two-state folding）特征，其协同性参数σ（sigma）值在0.8-1.2区间。而YibK在祖先字母表中σ值骤降至0.3以下，出现明显的中间态积累，表明深结蛋白的折叠协同性高度依赖特定氨基酸组合。

【动力学效率比较】通过10⁶次蒙特卡洛步长的轨迹分析发现，祖先字母表使多肽链更易形成非特异性结（non-specific knots），其结形成速率比现代字母表快3倍。但对YibK而言，这种高效打结反而导致正确结形成概率下降60%，形成"速度-精度"权衡现象。

【结构组装能力】接触图分析显示，10氨基酸字母表下FN3的β-三明治折叠（beta-sandwich fold）和MJ0366的浅结结构仍能保持80%以上原生接触，但YibK的核心接触保留率不足50%，其结环区（knot loop）出现显著结构松动。

这项研究首次通过逆向进化框架证明，氨基酸字母表的扩展主要受以下选择压力驱动：提升蛋白质热稳定性、优化折叠协同性、以及解决深结蛋白特有的"折叠-结形成"矛盾。特别重要的是，发现早期氨基酸字母表（如假想的10氨基酸祖先系统）已具备组装复杂蛋白质结构的能力，但对深结蛋白的折叠支持存在固有缺陷。这为解释现代蛋白质中深结罕见现象提供了全新视角——可能并非深结本身不利，而是早期生物化学系统难以支持其可靠折叠。该成果不仅深化了对蛋白质进化约束的理解，也为合成生物学中最小氨基酸字母表设计提供了重要理论依据。