一种新型热激活单管RPA-CRISPR-Cas12b技术用于肺炎支原体即时检测(TRACER)

为解决肺炎支原体(M. pneumoniae)检测中两步法操作复杂、气溶胶污染风险高的问题，研究人员开发了基于温度调控的单管RPA-CRISPR-Cas12b检测技术(TRACER)。该技术通过精确温控实现重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR-Cas12b的顺序激活，检测限达1拷贝/μL，临床验证显示99.2%的灵敏度和100%的特异性，为呼吸道病原体POCT提供了创新解决方案。

　　

肺炎支原体作为呼吸道感染的重要病原体，每年导致20%-40%的儿童呼吸道感染病例。这种微生物引发的临床症状往往缺乏特异性，从普通头痛咳嗽到可能致命的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)都有可能发生。更棘手的是，约12%的住院患儿需要转入重症监护室(ICU)治疗。然而，现有的诊断方法各有限制：金标准的PCR检测需要昂贵设备和专业操作；血清学检测耗时且灵敏度不足；而细菌培养则面临技术复杂、周期长的困境。

针对这一临床痛点，南方医科大学南方医院检验医学科/广东省精密医学诊断重点实验室的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表了一项突破性研究。他们巧妙利用重组酶聚合酶扩增(RPA)和CRISPR-Cas12b系统的最适温度差异，开发出名为TRACER（热激活RPA扩增CRISPR-Cas12b高效识别）的创新检测技术。该技术仅需普通智能手机读数和便携式加热装置，就实现了从核酸扩增到信号检测的全流程整合。

研究采用三步关键技术：首先基于嗜热菌Bacillus hisashii来源的BrCas12b构建检测系统，其60°C以上的最适温度与RPA的39°C形成天然屏障；其次设计温度转换程序，先39°C进行25分钟RPA扩增，再升温至66°C激活Cas12b进行15分钟检测；最后采用195例临床样本验证性能，所有操作均在密闭单管内完成。

【初步构建TRACER】部分显示，经过系统优化的F1R4引物对与特异性crRNA组合，成功建立了针对肺炎支原体P1基因的检测体系。温度梯度实验证实，BrCas12b在低于50°C时几乎无活性，而66°C时切割效率达到峰值，这种温度依赖性完美解决了传统单管系统中Cas蛋白过早降解模板的难题。

【结论】部分强调，TRACER技术将检测灵敏度提升至1拷贝/μL，较传统RPA-CRISPR-Cas12a系统提高100倍。临床验证中，对120例阳性样本检出119例，75例阴性样本全部正确识别，总体准确率达99.5%。这种无需物理分隔或光敏crRNA的设计，大幅降低了成本和操作门槛。

该研究的突破性在于：首次利用温度门控原理实现RPA与CRISPR-Cas12b的时空分离，攻克了单管系统中扩增效率与检测灵敏度的矛盾；开发的便携式检测装置仅重500g，配合智能手机读数，真正满足床旁检测需求；每测试成本控制在5美元以内，为资源有限地区的肺炎支原体诊断提供了可行方案。正如作者指出，这种"温度开关"设计理念可拓展至其他病原体检测，为下一代分子诊断技术开发提供了新范式。