基于N-炔丙基吡咯烷结构的丁酰胆碱酯酶与单胺氧化酶双靶点抑制剂的设计、合成与神经保护作用研究

本研究针对阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等神经退行性疾病的治疗需求，设计合成10种新型N-炔丙基吡咯烷类化合物。研究发现磺酰胺类化合物10是人丁酰胆碱酯酶(hBChE)最强抑制剂(IC50=0.203 μM)，而仲酰胺类化合物1可同时不可逆抑制hMAO-A/B(IC50分别为6.42/7.83 μM)。晶体结构揭示了独特的结合模式，且化合物1和10具有穿透血脑屏障能力、低细胞毒性和Aβ1-42神经保护作用，为开发新型神经保护药物提供了重要线索。

　　

神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)正日益成为全球公共卫生挑战。这些疾病与胆碱能系统功能障碍和单胺类神经递质代谢异常密切相关。丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase, BChE)作为乙酰胆碱酯酶(AChE)的同工酶，在AD晚期阶段作用尤为突出；而单胺氧化酶(Monoamine oxidase, MAO)则通过调控多巴胺、5-羟色胺等神经递质水平影响PD等疾病进程。目前临床使用的相关抑制剂多为单靶点药物，且存在外周副作用等问题，亟需开发能同时调节多个靶点的新型治疗药物。

针对这一需求，斯洛文尼亚卢布尔雅那大学药学院(Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana)的研究团队基于前期发现的N-炔丙基哌啶类双靶点抑制剂，通过"骨架跃迁"(scaffold hopping)策略设计合成了一系列N-炔丙基吡咯烷类化合物。这类结构通过缩小环系尺寸(从六元哌啶环变为五元吡咯烷环)降低分子量(MW)、拓扑极性表面积(tPSA)和可旋转键数(NRB)，旨在改善药物穿透血脑屏障(BBB)的能力。相关研究成果发表在《Chemico-Biological Interactions》期刊。

研究人员采用多学科技术方法开展研究：通过Ellman法测定胆碱酯酶抑制活性，使用基于Amplex Red的荧光法检测MAO抑制活性；借助X射线晶体学解析抑制剂与hBChE的复合物结构；采用平行人工膜渗透实验(PAMPA-BBB)评估血脑屏障穿透性；通过MTS法和流式细胞术评价细胞毒性和Aβ_1-42诱导的神经保护作用。

2.1 设计
研究团队保留了对hBChE抑制关键的萘环和对MAO抑制必需的N-炔丙基，通过系统修饰酰胺/磺酰胺氮上的取代基(R基团)，设计出10个目标化合物。这种结构优化策略成功降低了分子参数(MW减少14-28 Da，tPSA减少10-20 ?²)。

2.2 合成
采用正交保护策略，以吡咯烷-3-甲胺为起始原料，经Boc保护、脱苄基、炔丙基化和最终酰化/磺酰化等步骤，高效构建目标分子库，所有终产物纯度均>95%。

2.3 体外酶抑制
所有化合物均选择性抑制hBChE(IC₅₀ 0.203-56.3 μM)而不影响hAChE(IC₅₀ >100 μM)。其中磺酰胺类化合物普遍比相应酰胺类活性更高，化合物10成为最强hBChE抑制剂。值得注意的是，仅仲酰胺化合物1表现出对hMAO-A/B的双重抑制，提示氮原子上取代基对MAO抑制的选择性具有决定性影响。

2.4 抑制机制
通过IC₅₀曲线漂移实验和100倍稀释实验证实，化合物1是时间依赖性、不可逆的MAO抑制剂，这与典型炔丙胺类抑制剂通过共价修饰FAD辅基的机制一致。计算得到其对hMAO-B的K_I=5.92 μM，k_inact=0.0058 s^-1。

2.5 晶体结构
hBChE-化合物4复合物结构(PDB 9R9D)显示其-(CH₂)₂OCH₃基团最佳占据胆碱结合口袋，与Trp82相互作用；而hBChE-化合物10复合物(PDB 9R9E)则显示磺酰胺氧与Thr120形成氢键，导致吡咯烷环翻转和结合模式改变。与先前报道的哌啶类似物(PDB 5LKR)相比，吡咯烷类呈现显著不同的结合姿态。

2.6 血脑屏障渗透
PAMPA-BBB显示化合物1和10的渗透性(P_app分别为225.8和256.1 nm/s)与已知脑渗透药物多奈哌齐(224.6 nm/s)相当，预示良好中枢活性。

2.7 细胞活性
两种化合物在SH-SY5Y和HepG2细胞中均显示低细胞毒性(LD₅₀ >50 μM)，并能显著降低Aβ_1-42诱导的7AAD阳性细胞比例，证实其神经保护作用。

该研究成功开发了一类结构新颖的N-炔丙基吡咯烷类双靶点抑制剂，其中化合物10成为迄今报道最强的hBChE抑制剂之一，而化合物1则展现出独特的hMAO-A/B双重抑制特性。晶体学研究首次揭示了吡咯烷类与哌啶类抑制剂在hBChE活性位点的差异化结合模式，为后续理性药物设计提供了结构基础。尤其值得注意的是，这类化合物不仅具备良好的脑渗透性和安全性，还能抵抗Aβ毒性，显示出治疗AD等多因素神经退行性疾病的巨大潜力。研究结果对开发新一代多靶点神经保护药物具有重要指导意义，为应对全球老龄化带来的神经退行性疾病挑战提供了新的分子工具和治疗思路。