DCL5缺失诱导硬粒小麦温度敏感型雄性不育并揭示AU富集基序调控24-nt phasiRNA生成机制

本研究揭示了硬粒小麦DICER-LIKE 5（DCL5）基因缺失导致温度敏感型雄性不育（TGMS）的分子机制，发现其通过影响24-nt生殖相小干扰RNA（phasiRNA）的生物合成途径调控花粉发育。研究证实单个DCL5等位基因即可恢复育性，为小麦杂交育种提供了新型核基因控制体系，同时鉴定出指导premeiotic 24-nt phasiRNA生成的AU富集基序，并揭示ARGONAUTE（AGO）同源基因在phasiRNA产生细胞中的共表达模式。

　　

【Loss of DCL5 Induces Temperature-Sensitive Genic Male Sterility】
在硬粒小麦（Triticum turgidum ssp. durum 2n=4×=28）中，DCL5基因的双突变体（aabb）表现出温度依赖的雄性不育特性。标准生长条件下（20°C/15°C）完全不育，而在高温条件（≥22°C）下可部分恢复育性。细胞学分析揭示不育表型出现在减数分裂后的花粉成熟期，表现为绒毡层异常增厚形成"瑞士奶酪"样结构，花粉壁发育缺陷以及花药开裂障碍。单细胞RNA测序发现，在24-nt phasiRNA积累的premeiotic阶段，dcl5突变体细胞已出现独特的转录组特征。

【Depletion of Premeiotic and Meiotic 24-nt phasiRNAs】
sRNA测序显示DCL5缺失导致2699个24-nt phasiRNA位点完全消失，包括1622个premeiotic位点和1077个meiotic位点，而21-nt phasiRNA通路不受影响。值得注意的是，在恢复育性的高温条件下，meiotic 24-PHAS前体在premeiotic阶段即提前积累，提示温度可能重编程phasiRNA通路的时序调控。

【Developmental Defects during Pollen Maturation】
电子显微镜观察发现dcl5突变体在18°C条件下出现Ubisch小体分布异常、花粉壁厚度失衡（内侧增厚/外侧变薄）以及花粉粘连现象。与表型时序矛盾的是，24-nt phasiRNA积累高峰（premeiotic和meiotic阶段）并未伴随明显形态学异常，暗示这些sRNA可能通过表观遗传调控为后期发育"预编程"。

【Unique Biogenesis Mechanism of Premeiotic 24-nt phasiRNAs】
通过nanoPARE和降解组分析，研究首次证实premeiotic 24-nt phasiRNA的生成不依赖miRNA介导的切割，而是通过保守的AU富集基序（5'-UAAUUCCUC-3'）引导DCL5活性。与meiotic 24-PHAS（由miR2275触发）不同，premeiotic前体未检测到特异的切割信号，但phasiRNA从基序下游12-24nt处起始，仍保持精确的相位分布。

【AGO Effectors and Transcriptional Regulation】
单细胞转录组分析鉴定出三个dcl5特异的细胞簇，这些细胞在premeiotic阶段已表现出转录组差异。在推定绒毡层细胞中，AGO1b、AGO4a和AGO6同源基因呈现阶段特异性共表达模式：AGO1b在premeiotic期高表达，而AGO4a/AGO6在premeiotic和meiotic期持续表达。结合这些AGO蛋白在拟南芥RNA导向DNA甲基化（RdDM）通路中的作用，推测24-nt phasiRNA可能通过表观沉默机制调控生殖发育。

该研究不仅为小麦杂交育种提供了可温度调控的DCL5-TGMS系统（仅需单个野生型等位基因即可恢复育性），更揭示了植物生殖发育中非经典phasiRNA通路的分子机制。AU富集基序的发现为理解小RNA多样性生成提供了新视角，而温度敏感的表型则暗示24-nt phasiRNA通路可能在作物环境适应性进化中发挥重要作用。