GFAP基因突变通过改变类器官早期谱系定向影响神经发育的机制研究

这篇研究揭示了胶质纤维酸性蛋白（GFAP）突变在亚历山大病（AxD）患者来源诱导多能干细胞（iPSCs）类器官模型中的新作用机制。通过多组学分析发现，GFAP突变会干扰胚胎体（EBs）的机械信号感知，导致神经外胚层（neuroectoderm）定向异常并激活中胚层（mesoderm）相关通路。研究首次证实GFAP在iPSCs中的表达及其磷酸化（pSer13-GFAP）对早期发育的调控作用，为理解中间丝蛋白（IFs）在神经发育障碍中的作用提供了新视角。

　　

GFAP突变对类器官早期发育的干扰机制

3.1 突变GFAP破坏神经类器官的神经外胚层发育
研究团队使用携带R239C突变的AxD患者来源iPSCs构建非定向神经类器官（UNOs），发现突变组在培养第9天即出现异常形态学特征——边缘呈现气泡状突起，而对照组则形成典型的神经上皮结构。免疫荧光显示突变组显著缺乏神经外胚层标志物PAX6和SOX2表达，且GFAP呈现病理性聚集体而非正常纤维结构，类似亚历山大病特征性Rosenthal纤维（RFs）。

3.2 GFAP敲除部分挽救发育缺陷
通过CRISPR/Cas9技术构建GFAP敲除（KO）的R239C-AxD-2 iPSC系，发现KO类器官虽恢复圆形胚胎体形态并表达SOX2，但PAX6表达仍低于对照组。Western blot证实KO系完全缺失GFAP蛋白，提示突变GFAP是神经定向异常的主因，但完全挽救需其他补偿机制。

3.3 转录组揭示谱系定向紊乱
时序RNA-seq分析显示，突变类器官早期即下调PAX6、EMX2等神经发育基因，上调GATA2、TNNT2等中胚层基因。GO分析发现"金属离子应激反应"和"膜筏组装"等通路激活，而"前脑发育"和"Wnt通路"被抑制，表明机械信号传导异常导致谱系偏移。

3.4-3.6 机械约束与干预策略
研究团队发现：

1. 降低细胞密度或改用圆底板培养（直接播种法）可避免形态异常，但神经分化仍延迟
2. 双SMAD抑制剂（DSi）强制神经诱导可恢复PAX6表达
3. 比较转录组显示突变类器官对Aggrewell800几何约束更敏感，特异性激活"心肌发育"和"钙粘蛋白结合"通路

3.7 多突变验证与干预普适性
在R88C、R416W等不同GFAP突变模型中均观察到类似表型，且DSi处理能普遍挽救神经分化缺陷，证实该机制具有突变非依赖性。

3.8 GFAP在iPSCs中的意外表达
免疫染色和Western blot首次证实GFAP在iPSCs中的非纤维状表达，磷酸化GFAP（Ser13）定位于细胞核和有丝分裂纺锤体。cDNA测序验证突变等位基因的转录活性，提示GFAP可能参与干细胞周期调控。

4 讨论
该研究突破性发现：

1. GFAP作为机械信号调节器影响早期谱系决定
2. 类器官培养方法（几何约束强度）可显著改变表型输出
3. 磷酸化GFAP在干细胞中的功能为全新研究维度
   这些发现为理解中间丝蛋白在发育疾病中的作用提供了新范式，并为优化类器官模型构建提供了重要方法论参考。