海水环境后生动物细胞的分离与遗传鉴定：单细胞基因组学在海洋生物监测中的突破

这篇研究开创性地建立了从海水样本中分离环境后生动物细胞（emCells）的技术体系，通过荧光激活细胞分选（FACS）结合鱼类特异性分子探针（12S-fish-AF647），成功实现了对鱼类脱落细胞的富集（25%靶向率）。研究采用双标记（DAPI/AF647）成像流式细胞术验证细胞完整性，并通过多重PCR（靶向18S核DNA和16S线粒体DNA）证实了单细胞基因组分析的可行性，为海洋生物种群遗传学研究提供了非侵入性采样新范式。

　　

摘要

研究团队开发了一种革命性的环境后生动物细胞（emCells）分离技术，定义为"从后生动物脱落到环境中的完整细胞"。通过定制鱼类探针（12S-fish-AF647）和新型多因子FACS分选方案，成功从海水mesocosm样本中富集靶细胞，流式细胞术显示目标细胞群密度显著改变。成像流式证实了单细胞的双重核/线粒体染色特征，多重PCR显示25%分选细胞为鱼类，序列与mesocosm已知物种匹配。尽管存在非靶细胞干扰，该方法为获取传统eDNA无法提供的个体基因组信息开辟了新途径。

1 引言

传统环境DNA（eDNA）宏条形码技术面临基因组完整性破坏的瓶颈。微生物领域虽已实现环境单细胞分离，但后生动物细胞分离技术尚未突破。本研究首次建立海洋后生动物细胞分离体系，通过>5μm粒径分级捕获完整细胞，结合FISH-FACS联用技术，克服了eDNA片段化导致的个体基因型丢失问题。

2 材料与方法

2.1 样本采集

从西澳大利亚水族馆（AQWA）300万升主缸采集80L海水，经5μm膜过滤后，使用85/40μm细胞筛分级获取5-40μm生物材料。

2.2 鱼类特异性探针

设计靶向12S rDNA的AF647标记探针（GGTAAAACTCGTGCCAGC），经BLAST验证对硬骨鱼/软骨鱼的特异性。采用改良Hui氏FISH方案，74℃变性后37℃杂交16小时，DAPI复染核DNA。

2.3 成像流式验证

使用Amnis ImageStreamX mark II双相机系统，405/642nm激光分别激发DAPI（430-505nm）和AF647（642-745nm），60倍EDF成像确认探针细胞内定位。

2.4 FACS分选策略

BD FACSMelody分选仪采用三级门控：

1. 前/侧向散射排除碎片
2. SSC/FSC单细胞门排除聚集体
3. 布尔AND门控双阳性（DAPI⁺/AF647⁺）细胞
   分选速率1-10细胞/秒，直接存入96孔板。

2.5 分子分析

单细胞直接PCR扩增：

• 18S核DNA引物（CACCGCCCGTCGCTACTACCG/GGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACG）
• 16S mtDNA引物（GACGAGAAGACCCTGTGGAGC/CCGYGGTCGCCCCAAC）
  Illumina iSeq 100测序后，eDNAFlow流程进行LCA分类。

3 结果

3.1 分选效率

360个分选细胞中：

• 18S库：53%单分类单元（9%靶细胞）
• 16S库：98%单分类单元（98%靶细胞）
  双验证率仅6%，但所有检出物种均与mesocosm匹配。

3.2 分类组成

• 软骨鱼占比54%（如Carcharhinus amblyrhynchos）
• 硬骨鱼46%（如Lutjanus sebae）
  18S库中非靶细胞主要为藻类（44%）和单细胞真核生物（25%）。

4 讨论

4.1 技术突破

首次实现海洋后生动物单细胞分选与基因组分析，突破eDNA片段化限制。软骨细胞捕获优势可能与细胞脱落机制有关。

4.2 挑战与优化

• 藻类自发荧光干扰（叶绿素与AF647光谱重叠）
• 45%扩增失败率（改进后仍优于前人7-15%）
  建议增加阴性门控标记提高特异性。

4.3 应用前景

emCells支持：

1. 个体识别（多基因座分型）
2. 绝对种群估算（CKMR技术）
3. 基因流/性别比分析
   相较eDNA宏条形码，可获取个体水平遗传参数。

5 结论

该技术突破为海洋生物研究提供了"环境活检"新工具，未来通过物种特异性探针优化，将在濒危物种监测、入侵种追踪等领域产生变革性影响。