缺氧诱导神经干细胞通过HIF-1α/RAB17通路驱动细胞外囊泡释放促进脊髓损伤修复

这篇研究揭示了缺氧条件下神经干细胞（NSCs）通过HIF-1α/RAB17通路促进细胞外囊泡（EVs）释放的机制，并开发了CAQK/Angiopep2双肽修饰的靶向EVs递送系统。研究证实，尽管移植的NSCs存活率低且分化受限，但其分泌的缺氧诱导EVs（hypoNSCs-EVs）可通过调节血管生成、抗炎和神经再生显著改善脊髓损伤（SCI）修复。该成果为开发无细胞精准疗法提供了新策略。

　　

移植NSCs的修复作用与凋亡困境

研究团队从转基因EGFP小鼠脊髓中提取神经干细胞（NSCs），通过基质胶移植至脊髓完全横断模型小鼠损伤部位。尽管移植后EGFP⁺ NSCs主要分化为星形胶质细胞（GFAP⁺），神经元（NeuN⁺）分化极少，且24小时内细胞凋亡率超60%（TUNEL⁺），但移植组8周后仍表现出显著的后肢运动功能恢复（BMS评分提升）和电生理改善（MEP振幅增强）。组织学分析显示，NSCs移植促进胶质瘢痕收缩（CSPG⁺面积减少）、血管重塑（CD31⁺血管直径减小）及神经纤维再生（NF⁺信号增加）。

缺氧应激触发EVs释放的关键机制

缺氧探针检测证实移植NSCs在损伤部位处于缺氧状态（Hypoxyprobe⁺）。体外实验发现，1% O₂缺氧18小时可诱导NSCs内多泡体（MVBs）数量增加2倍，EVs标志物CD63/CD9/TSG101表达上调，且HIF-1α表达达峰值。通过CD63-copGFP标记技术，证实缺氧NSCs分泌的EVs可被神经元、小胶质细胞（CD11b⁺）和内皮细胞（CD31⁺）摄取。移除EVs的缺氧条件培养基（hypo-CM-EVs-rm）则丧失促血管生成（Matrigel中CD31⁺微血管密度降低50%）和抗炎作用（BV2细胞iNOS下调40%）。

HIF-1α/RAB17通路的调控作用

RNA-seq分析显示，缺氧NSCs中1532个基因上调，包括HIF-1α通路相关因子PDK1/FLT1和EVs分泌关键调控分子RAB17（表达量增加5倍）。shRNA敲低RAB17后，CD63与RAB17的共定位荧光点减少70%（3D-τ-STED超分辨成像），EVs分泌量下降60%（NTA检测）。体内实验表明，移植RAB17-KD NSCs的小鼠神经纤维再生（NF⁺信号减少45%）和运动功能恢复（BMS评分降低2分）显著受损。

缺氧EVs的再生潜能与工程化改造

蛋白质组学鉴定出hypoNSCs-EVs中富含神经再生因子（Ccnd1/Adnp）、促血管蛋白（Vegfa/Pdcl3）和抗炎介质（Atf7ip）。通过DSPE-PEG2000-CAQK/Angiopep2双修饰的EVs在脊髓挫伤模型中展现出精准靶向性：DiR标记显示其在损伤部位的富集度比未修饰EVs高3倍（IVIS成像），且能高效被神经元、CD11b⁺和CD31⁺细胞摄取（PKH67⁺斑点数增加80%）。治疗4周后，双修饰EVs组胶质瘢痕面积缩小35%，炎症因子CD68⁺细胞减少60%，运动功能评分（BMS）提升至6.5分。

临床转化意义与创新性

该研究突破性地提出缺氧预处理可增强NSCs-EVs的治疗效能，并通过CAQK（靶向脱髓鞘区域）和Angiopep2（穿透血脑屏障）的双重修饰实现精准递送。这种无细胞疗法规避了传统干细胞移植的免疫排斥和致瘤风险，为脊髓损伤提供了可规模化生产的生物制剂新选择。