基于新一代测序技术的人巨细胞病毒抗病毒耐药突变检测与基因分型新方法

这篇综述介绍了一种基于新一代测序（NGS）的创新方法，用于人巨细胞病毒（HCMV）的抗病毒耐药突变检测和基因分型。该方法通过多重PCR扩增靶向UL27、UL54、UL55、UL56、UL89和UL97基因，结合Illumina MiSeq平台测序，可同时检测（val）ganciclovir、foscarnet、cidofovir、maribavir和letermovir等药物的耐药突变，并实现gB基因分型。验证显示该方法灵敏度达17,894.60 IU/mL，能识别低至5%的变异频率，显著优于传统Sanger测序，为免疫抑制患者的精准诊疗提供了新工具。

　　

引言

人巨细胞病毒（HCMV）在免疫抑制患者中可导致严重疾病，抗病毒药物如更昔洛韦（GCV）和缬更昔洛韦（VGV）的耐药性问题日益突出。传统Sanger测序仅能检测>20%的变异，而新一代测序（NGS）技术可识别低至5%的变异，为耐药监测提供新思路。

材料与方法

2.1 引物设计
基于PrimalScheme设计覆盖UL27、UL54、UL55（gB分型区）、UL56、UL89和UL97基因的25对引物，通过多重序列比对优化，确保覆盖度达94%-99%。引物分为3组以避免二聚体形成，如UL54基因覆盖98.71%（3681/3729 bp）。

2.2 多重PCR扩增
使用Q5高保真DNA聚合酶进行三组多重PCR，条件为98°C 15分钟预变性，35个循环（95°C 15秒，62°C 5分钟）。UL97基因因5'端保守性差，与相邻UL96基因共同扩增。

2.3 NGS测序
Illumina MiSeq平台进行双端101 bp测序，105个样本（含40个验证样本）同时上机。数据经Trimmomatic质控后，使用SPAdes进行从头组装，Bowtie2去除宿主序列。

2.4 数据分析
自主开发流程包括：

• 变异检测：LoFreq识别≥5%频率的变异，深度≥100×，链偏差（SB）<30
• 耐药注释：minMutFinder工具参照Tilloy标准
• gB分型：比对gB1-gB4参考序列（如gB1 M60927）

验证结果

3.1 重复性验证
ATCC AD-169株14次重复显示：

• 所有基因覆盖100%，深度>100×
• 仅UL89检出1个低频变异（G91C，AF 10.16%），为未报道新突变

3.2 与Sanger对比
21例临床样本比较：

• UL54：6/18样本检出Sanger未发现的低频突变（如C592G，AF 22.64%）
• UL97：3/19样本检出新变异，但耐药表型判断100%一致

3.3 外部质控
QCMD CMVDR24项目5个样本验证：

• 准确识别所有已知耐药突变（如UL54 L545S、UL97 M460V）
• 检出UL56 C325W（letermovir耐药）

3.4 gB分型

• ATCC株14次重复均正确归类为gB2型
• 合成数据验证可区分gB1-gB4混合感染

3.5 检测限
稀释实验确定最低检测限为17,894.60 IU/mL。5例临床样本（3,000-310,000 IU/mL）中，UL89覆盖度达98.47%，其余基因均100%覆盖。

讨论

本研究建立的NGS方法具有三大优势：

1. 广谱性：单次检测覆盖6个基因，包括新型药物靶点（如UL27对maribavir）
2. 高敏性：可识别5%低频变异，早于Sanger发现耐药萌芽
3. 双功能：兼具耐药检测（如UL97 M460V）和流行病学分型（gB1-gB4）

局限性包括UL89在低病毒载量时覆盖度略降（95.02%），且需进一步临床验证与表型关联。未来可扩展至其他疱疹病毒（如EBV、HSV）的耐药监测。

结论

该NGS流程为HCMV耐药监测提供了全面解决方案，尤其适用于移植后长期抗病毒治疗的患者。其高通量、低成本的特点有望推动耐药检测从科研向临床常规应用的转化。