RADseq技术对比研究：连锁图谱与关联分析在大型基因组同形性染色体标记鉴定中的应用

这篇研究通过对比RADseq（限制性酶切位点关联DNA测序）的两种策略——连锁图谱构建与已知性别关联分析，在蝾螈（Lissotriton vulgaris）这一具有超大基因组和同形性染色体的模式生物中，成功鉴定了Y染色体连锁标记。研究不仅开发了跨物种适用的PCR性别鉴定方案，还揭示了在微小性别决定区域中关联分析法的优势，为基因组学工具选择提供了重要指导。

　　

摘要

研究团队针对缺乏性别连锁序列信息的类群，比较了两种基于RADseq的性别标记鉴定策略。以基因组庞大（27.7-32.0 Gbp）且具有同形性染色体的普通蝾螈（Lissotriton vulgaris）为模型，通过关联分析法（60只已知性别成体）和连锁图谱法（146只未知性别后代家系）展开研究。结果显示，经基因组旁系同源序列优化后，关联分析鉴定出5个Y连锁标记，并开发出适用于4个近缘物种的PCR性别鉴定方案；而连锁图谱虽构建了包含10,763个标记的高密度图谱，但未结合关联分析结果时，无法通过标记密度或父系特异性标记簇明确识别性别决定区域。

1 引言

性别连锁标记在农业育种、生态保护及进化研究中具有核心价值。然而，快速演化的性别决定系统（如鱼类、有尾目）常伴随微小且未分化的性别决定区域，使得标记开发极具挑战。研究以蝾螈为对象，其基因组因大量重复序列扩张而异常庞大，且缺乏可用基因组组装。RADseq因其低成本、全基因组覆盖特性成为理想选择，但不同策略（关联分析vs连锁图谱）的适用场景尚不明确。

2 方法

样本采集：波兰克拉科夫地区采集60只已知性别成体，培育146只后代家系。

RADseq优化：采用Adapterama III双酶切方案，针对高旁系同源基因组调整Stacks参数（M=2/6/10），比较不同严格度下的标记筛选效率。

性别标记筛选：通过雄性特异性存在/缺失模式初筛，BLAST过滤旁系同源序列，最终设计25对引物验证。

连锁图谱构建：使用Lep-MAP 3整合常规SNP与人工转换的Y连锁"伪基因型"，建立父本/母本/性别平均图谱。

比较基因组学：将标记与伊比利亚肋突螈（Pleurodeles waltl）基因组比对，评估保守共线性。

3 结果

关联分析成效：参数M=10时筛选效率最高，53%候选标记无旁系同源，5个标记在L. vulgaris中验证为雄性特异。标记LvY-79,267和LvY-51,393的组合可实现平滑蝾螈复合群（含L. montandoni等）的跨物种性别鉴定，但在远缘物种（如L. helveticus）中失效。

连锁图谱特征：构建的12个连锁群（总长1366 cM）与蝾螈核型匹配，与P. waltl基因组显示广泛共线性。32个Y连锁标记密集分布于第5连锁群末端（<2 cM），但该区域父本重组抑制现象不如预期显著。

局限性：仅0.03%的连锁标记能定位到P. waltl基因组，且父本特异性SNP的富集程度（p=7.77×10^-10）不足以独立识别性别区域。

4 讨论

研究证实：

1）关联分析法在超大基因组中仍有效，关键是通过提高Stacks的M参数抑制旁系同源干扰；

2）连锁图谱虽能精确定位已知标记，但对微小性别区域（可能<1.4%染色体长度）敏感性不足；

3）蝾螈Y染色体重组模式存在地理变异，波兰种群与德国种群（Schmid et al. 1979）的细胞遗传学观察存在差异。

该成果为同形性染色体物种的性别标记开发提供了方法论范式，尤其适用于基因组庞大、样本量受限的研究场景。未来可结合长读长测序进一步解析性别决定区域的精确结构与演化动态。