基于磺基甜菜碱修饰聚(α-L-赖氨酸)多层涂层的CZE-MS技术增强完整蛋白质及蛋白质形态分离研究

这篇研究创新性地采用磺基甜菜碱修饰的聚(α-L-赖氨酸)(α-PLL)多层涂层调控毛细管区带电泳(CZE)的电渗流(EOF)，显著提升了蛋白质形态(proteoforms)的分离分辨率。通过调整涂层中修饰侧链比例，实现了对低迁移率蛋白质（如含酸性翻译后修饰PTMs的蛋白）的高效分离，在酵母蛋白质组分析中使低迁移率区间蛋白质形态鉴定数量提升2.5倍。该技术为靶向/非靶向自上而下蛋白质组学(TDP)提供了灵活可调的分离工具箱。

　　

ABSTRACT

质谱(MS)驱动的自上而下蛋白质分析需要高效分离技术。毛细管区带电泳(CZE)凭借其高效分离电荷/尺寸变异体的能力，成为蛋白质形态分析的理想选择。研究团队发现，当反向电渗流(EOF)的绝对迁移率接近分析物有效迁移率时，CZE中双峰分辨率显著提升。基于此，开发了磺基甜菜碱修饰的α-PLL涂层，其EOF迁移率可通过侧链修饰程度精准调控。

材料与方法

涂层设计：通过将α-PLL的赖氨酸侧链与3-((羧甲基)二甲基铵)丙烷-1-磺酸酯偶联，合成不同修饰度(51%-71%)的聚合物。毛细管制备：采用连续多层离子聚合物(SMIL)技术构建五层涂层(PDADMAC-PSS-α-PLL)，记为PSPSL_X%。样本处理：测试模型蛋白(AGP、胎球蛋白、BSA、酪蛋白)及完整酵母蛋白质提取物，使用2M乙酸(HAc)作为背景电解质(BGE)。

结果与讨论

分辨率调控机制：EOF迁移率与蛋白质有效迁移率的匹配度决定分离效果。PSPSL_71%涂层(EOF=28.8 TU)对低迁移率蛋白(如AGP, μ_e=7.9-12.8 TU)的分辨率较PSPSP涂层(EOF=45.2 TU)提升1.7-2.2倍，成功实现相差单个磷酸化/唾液酸修饰的蛋白质形态基线分离。

酵母蛋白质组应用：180 cm毛细管结合PSPSL_71%涂层，在低迁移率区间(<21 TU)鉴定到978种蛋白质形态，较PSPSP涂层(387种)提升2.5倍。典型案例如烯醇酶2截短体，差异仅1个非带电氨基酸(丙氨酸)的形态也能实现基线分离。

迁移率预测模型：建立方程μ_e=5Q/M^2/3，证实蛋白质有效迁移率与净电荷(Q)正相关、与质量(M)负相关。该模型对94%分析物的预测误差<10%，为靶向分离提供理论指导。

电压-涂层协同优化：提高电压(-30 kV)可抵消低EOF导致的迁移时间延长，使PSPSL_71%在保持高分辨率的同时，分析时间与高EOF涂层相当。

结论

磺基甜菜碱修饰α-PLL涂层通过精准调控EOF迁移率，为酸性PTMs(如磷酸化、糖基化)富集的蛋白质提供"按需定制"的分离方案。该技术突破传统涂层在迁移率窗口选择上的局限，为复杂生物样本的深度蛋白质形态分析开辟新途径。